微生物SOP.docx

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微生物SOP

义乌市稠州医院

微生物程序管理文件

文件编号：

JYK-XJS-01

版序：

第一版

生效日期：

2005年06月01日

页码：

第1页共40页

一、微生物室的工作制度和管理

1.建立正确.快速的检验方法，认真核对并保存检验结果，签名后及时发出正确的病原学报告；

2.建立正确的药敏试验方法，药敏结果的审核，药敏规则标准化；

3.制定标本采集指南和规则，标本验收严格查对，发现不合格标本，重新留取，并做好标本清退记录；

4.建立完整的室内质控体系.参加每年两次室间质控的监测和考核；

5.每月承担临床对消毒.隔离.灭菌及环境污染的细菌学监测；

6.每季度提供临床流行病学资料，感染菌的发生率和耐药趋势；

7.保证检验质量，定期检查试剂和校对仪器灵敏度，掌握各种培养基的配制和用途，熟练各种仪器的操作和细菌鉴定系统的使用；

8.积极开展新的技术，新的检验项目，熟练掌握各种培养标本的操作规程和菌种鉴定；

9.熟悉安全防护规程，作好安全防范措施。

由污染区进入无菌区必须更换无菌衣.帽.口罩.手套等，做好培养标本废弃物的消毒处理，并做记录；

10.每日做好清洁卫生工作，操作台用1：

100施康擦拭，实验室每日紫外线消毒1小时，并记录；

11.严禁非工作人员进入，实验室严禁喧哗，确保安全工作。

12.按时上下班，离开实验室，检查水电.门窗，确保安全。

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文件编号：

JYK-XJS-01

版序：

第一版

生效日期：

2005年06月01日

页码：

第2页共40页

二、微生物室安全防护程序

目的：

保证实验室.实验人员和外部环境的安全。

1.熟悉各种仪器.设备的性能和使用方法，按规定进行操作；

2.加热易燃.易爆材料时，工作人员切忽随意离开，易燃品加热绝不能用明火；

3.要定期检查电器设备，防止因电火花.短路.超负荷引起线路起火；

4.工作人员进入无菌室，应更换一次性无菌衣.帽.口罩.手套等；用过的一次性物品放入专门污染袋，送医院集中处理。

5.每日实验室实验完毕进行紫外线消毒1小时，台面用1%施康消毒液擦拭，仪器表面用75%乙醇擦拭，还有其他物品的消毒清洁，消毒液每日更换，并作好记录；

6.临床标本.菌种等能引起感染或环境污染的物品妥善放置，处理标本时应穿工作服.戴手套，切忽接触皮肤及实验室清洁区。

如手或其他部位皮肤沾上标本和菌种，立即用肥皂冲洗干净，并用75%酒精消毒。

7.接种环或接种针用后切忽摆在实验台，应立即火焰灭菌；

8.废弃的细菌标本和菌种放在加盖的桶内，121℃高压消毒，交医院集中处理；

9.接触标本的吸管.吸嘴及涂制标本的玻片和废弃标本（如痰液.穿刺液.尿液等）不得随意丢弃，立即放入1%施康消毒液中。

浸泡6小时后，交医院集中处理。

10.在实验过程中，病人标本或试剂不慎溅入眼睛内，应立即用清水冲洗。

11.实验过程中被针具等锐器刺破时，应立即脱下手套，尽量挤压伤口，使血流出，然后用碘酒.酒精消毒，并进行预防补救措施和严格医学观察，以免造成感染。

12.在实验室中禁止做任何方式接触口腔的动作；

13.实验完毕离开，应脱下所有该实验区个人防护装备，一定用肥皂规范流水洗手。

必要时用消毒液处理。

14.遇有意外事故应立即报告科室负责人，当事人应立即注射相关疫苗或进行预防性治疗，并进行医学观察，严重者应报告院部技术负责人。

15.离开实验室，检查水，电，门窗，确保安全。

16.空气消毒记录表------------附表1

总之，实验室的生物防护措施，从技术角度讲有三大环节：

供应室的灭菌保证，实验室的生物防护措施.相应规章制度和实验人员的防护意识，实验室废弃物的处理。

应严格遵守各种相关规定和制度，提高实验室整体生物防护水平。

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JYK-XJS-01

版序：

第一版

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2005年06月01日

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第3页共40页

三、标本接收标准与不合格样品的处理

目的：

严格对各类送检样本进行合格查对验收，对病房样本及时进行验收，查对病人姓名，住院号，性别，年龄，病区，床号和检验项目等，不符合要求的样本一律退回，做好记录。

并及时通知相关科室医生或护士，正确及时得补采样，以免延误病人的检测结果报告。

1.血液和骨髓

严格防止标本次序混乱，按一人一瓶一单原则，在培养瓶上贴上标签，注明姓名、床号、住院号等。

化验单标明准确采样时间。

2.尿液标本

显微镜检查，观察20-30个视野，如有半数能见到细菌，则尿中细菌数104-106/ml，低于此值常为污染。

应重留标本。

3.痰液标本

挑取阳性（脓性或血）部分制备2张涂片，一张做革兰氏染色，另一张据需要做其它染色。

染色后低倍镜观察，如白细胞﹤10，上皮细胞＞25，或见到三种以上细菌说明为唾液，则要重留标本，不宜做培养。

4.穿刺液标本

未按照严格无菌操作，标本采集后未装入无菌容器，防止标本污染，提高真正病原微生物的检出率，要重留标本。

5.脓液.分泌物标本

感染部位与外界相通时，先用无菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用无菌棉拭子采集标本，申请单注明培养目的。

否则重留标本。

6.粪便标本

为了提高检出率，粪便标本要新鲜，挑取有脓血.粘液标本，液状盛于无菌容器，否则重留标本。

7.对不合格的标本应详细登记在标本清退记录本上。

8.必要时电话告之相关科室医生或护士。

正确及时得补采样，以免延误病人的检测结果报告。

9.细菌标本清退记录表---------附表2

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第4页共40页

四、培养基配制

目的：

正确的配制培养基，保证检验质量。

1.SS琼脂

100ml蒸馏水加6.2克干粉的比例配制，加热煮沸溶解，待冷至50℃左右倾注灭菌平皿凝固后备用。

2.4号琼脂

100ml蒸馏水加5.0克干粉的比例配制，加热煮沸1-2次，溶解后冷至60℃时加1﹪亚碲酸钾溶液0.2ml，摇匀后倾注无菌平皿。

3.沙保氏琼脂

100ml蒸馏水加6.3克干粉的比例配制，加热溶解。

经121℃15分钟灭菌倾注无菌平皿备用。

4.MH琼脂

100ml蒸馏水加3.8克干粉的比例配制，加热溶解。

经115℃20分钟灭菌，倾注直径90mm琼脂厚度4mm无菌平皿备用。

5.营养琼脂

100ml蒸馏水加3.8克干粉的比例配制,加热溶解。

经121℃15分钟灭菌,冷至约55℃，倾注无菌平皿备用。

6.碱性蛋白胨水

100ml蒸馏水加2.9克干粉的比例配制,加热溶解后分装试管，经121℃15分钟灭菌备用。

7.中国蓝培养基

100ml蒸馏水加4.1克干粉的比例配制,经115℃15分钟灭菌后倾注无菌平皿备用。

8.详细资料查看《培养基配制登记本》。

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JYK-XJS-01

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第5页共40页

五、K—B法抗生素报告选择

目的：

选择适合的抗生素，合理的使用抗生素，减少治疗错误，便于临床选择个体化治疗方案，节省费用,增强治疗效果。

非发酵菌:

1.舒普深2.丁胺卡那3.先锋必4.复达欣

5.泰能6.环丙沙星7.哌拉西林8.菌必治

9.庆大霉素10.头孢噻肟11.复方新诺明

肠杆菌科:

1.泰能2.丁胺卡那3.菌必治4.环丙沙星

5.哌拉西林6.庆大霉素7.复达欣8.先锋必

9.复方新诺明10.氨苄青霉素11.头孢噻肟

葡萄球菌:

1.苯唑西林2.复方新诺明3.庆大霉素4.环丙沙星5.万古霉素6.林可霉素7.红霉素8.青霉素9.阿奇霉素

链球菌/肠球菌:

1.苯唑西林2.青霉素3.红霉素4.环丙沙星

5.万古霉素6.林可霉素7.头孢噻肟8.四环素

9.高浓度庆大霉素10.高浓度链霉素

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第6页共40页

六、改良K-B法药敏试验操作程序

目的：

纸片扩散法药敏试验以抑菌环直径来表示该药对特定细菌的敏感程度分为敏感.中介度和耐药，分别以S.I和R来表示。

敏感（S）：

表示该军引起的感染可以用推荐剂量（常规剂量）的该抗菌药物治疗，禁忌症除外。

中介（I）：

表示抑菌环落入中介范围时意义不明确，如果没有其他可以替代的药物，需作稀释试验，根据MIC结果作出判断。

耐药（R）：

表示被测菌不能被常规剂量所能达到的组织或血液中的抗菌浓度所抑制。

1.M-H琼脂培养基的制备：

根据商品无水M-H琼脂粉要求配制，高压后平衡温度至45-50℃时倾注平

皿，使表面呈水平，厚度为4mm，冷却至室温，置35℃孵育24小时作无

菌试验，才能使用，放4℃保存，7日内有效。

2.抗菌药物纸片

密封包装放入-20℃或更低温度下保存。

常规使用纸片可以从低温中取出一

周用量。

抗菌药物纸片直径6.35mm，没片吸水量约20ul，以标准菌株做质量鉴定，一块平板贴6张相同纸片，记录6个抑菌直径，片间差不应>1-2mm。

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第7页共40页

3.测试平皿接种：

用无菌棉拭子浸入调节好的菌悬液，将多余菌悬液在管壁挤出，在M-H平

皿上划线，划满整个琼脂表面，旋转平皿60°重复划线共三次，最后一次

用拭子涂抹琼脂边缘。

4.贴纸片：

手工贴时必须使纸片与琼脂表面接触，每两个纸片中心距离不少于24mm。

纸片一旦贴在某一位置，就不能变动。

贴完纸片的平皿15分钟后再放入35℃

孵箱培养16-24小时。

5.读数：

用卡尺量取抑菌环的直径。

以没有明显肉眼可见生长物区域为抑菌圈边缘。

变形杆菌迁徙生长使抑菌环内生长的薄层菌可忽略不计。

抑菌环内生长层

<20%可以忽略不计。

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第8页共40页

七、特殊细菌药敏试验操作程序

目的：

随着高耐和多重耐药菌株的不断增多，耐药基因在细菌种内和种间的传播，以及抗菌药物的应用选择压力，使耐药菌株大量增殖。

还有某些抗菌药物对特定细菌的药敏结果，可能会出现误导的结果。

细菌室应在下述药敏结果报告中加以评论或注释以提供临床医生参考。

1.耐苯唑西林金黄色葡萄球菌（MRSA）：

M—H培养基，35℃24—48小时培养，判定标准：

1.甲氧西林（5ug）：

MIC≥16ug/ml,纸片法5ug/片≤9mm

2.苯唑西林（1ug）：

MIC≥4ug/ml,纸片法1ug/片≤10mm

3.意义：

对所有青霉素类.头孢菌素类.碳青霉烯类.碳头孢烯类和含酶抑制剂的复合制剂报告为耐药，不管MIC值或抑菌圈的大小是否属于耐药范围。

2.耐万古酶素肠球菌（VRE）：

1.中度耐药：

庆大霉素MIC62—500ug/ml；

2.高度耐药：

庆大霉素MIC≥500ug/ml,链霉素≥1000ug/ml,

万古霉素MIC≥8ug/ml

3.提示：

来自无菌体液的肠球菌必须做头孢噻吩试验检测B-内酰胺酶，阳性结果时自动报耐青霉素及氨苄西林，不管MIC值或纸片法结果是否符合。

3.产B-内酰胺酶的革兰阴性杆菌（ESBL）：

1.表型确诊试验：

代表菌株有肺炎克雷伯菌.大肠埃希菌等。

2.头孢他啶30ug+CD²30/10ug，头孢噻肟30ug+CD³30/10ug

3.在M-H培养基上对角相贴，35度孵育，18小时后观察结果。

4．对组的抑菌圈相比，增大值≥5mm时，判断为产ESBL

5.确定产ESBL菌株，对三代头孢菌素和氨曲南均应报告耐药。

4．耐青霉素肺炎链球菌（PRP）

1.判定标准：

青霉素耐药的肺炎链球MIC≥0.12ug/ml,MIC在0.12-1.0ug/ml间判为中介。

MIC≥2ug/ml判为耐药。

当抑菌环≥20mm可报告青霉素敏感，≤19mm用确定试验鉴别。

2.过筛试验用1ug/ml苯唑西林纸片

5.耐万古酶素的金黄色葡萄球菌（VRSA）

对万古酶素敏感性降低的金黄色葡萄球菌，MIC8-16ug/l。

并对万古霉素治疗无效。

，加强对所有葡萄球菌对万古霉素耐药的监测。

5.沙门氏菌和志贺氏菌：

一.二代头孢及氨基糖苷类即使体外试验显示敏感，但临床使用无效。

6.

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第9页共40页

八、微生物标本采集标准操作程序

目的：

保证所采集的标本符合实验要求，保证标本的检验质量。

1.血液培养：

通常在未使用抗生素之前，病人发热初期或发热高峰时，无菌操作多部位多次采集，每瓶成人5-10ML，儿童3-5ML。

骨髓每瓶1-2ML。

马上送检，决不能放入冰箱保存；

2.尿液培养：

通常在未使用抗生素之前，清洗尿道口，无菌操作，采集清晨中段尿装入无菌试管尽快送检；

3.粪便培养：

通常在未使用抗生素之前，腹泻病人应尽量在急性期采集，放入无菌容器送检；

4.痰培养：

通常在未使用抗生素之前，采集前用漱口液充分漱口，取得清晨深部的痰液，放入无菌容器送检；

5.穿刺液培养：

通常在未使用抗生素之前，无菌操作采集标本1-2ML，放入无菌试管，马上送检。

脑脊液不能放冰箱保存；

6.脓液培养：

通常在未使用抗生素之前，先用无菌生理盐水冲洗表面，再用无菌拭子采取标本，马上送检；

7.生殖道标本培养：

通常在未使用抗生素之前，先清洗尿道口，用无菌拭子采取标本，或放入无菌容器，马上送检；

8.真菌培养：

用75%酒精消毒皮肤，刮取感染皮肤边缘，放入无菌容器送检；

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2005年06月01日

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第10页共40页

九、临床培养标本的处理标准操作程序

目的：

选择相应的培养基，正确的采集标本，标准化的处理标本，保证检验的结果。

一.血液及骨髓液标本的处理

健康人的血液是无菌的，当人体局部感染向全身播散和出现全身感染时，血液中可出现细菌，依程度不同分为菌血症.败血症或毒血症。

当细菌侵入骨髓可引起严重的骨髓炎。

常见病原菌：

沙门氏菌，大肠埃希菌，葡萄球菌，铜绿假单胞菌，真菌，肠球菌等。

1.标本：

血液骨髓

2.培养基：

用营养较高的血液增菌培养基，单相或双相。

4.培养：

血液与培养基以1：

10比例为宜，骨髓1-2ML，35℃培养箱孵育18-24小时，在血平板传种一次。

以后每天两次观察生长情况，如有浑浊.溶血等异常现象，则从上述增菌液接种于血平板。

如无可疑生长，至五天必须移种血平板，根据培养结果，报告“五天培养无细菌生长”。

有菌生长，选择相应测试板鉴定，最后发报告。

二.尿液标本的处理

尿液通常是无菌。

当外尿道的一些细菌如：

大肠埃希氏菌.金黄色葡萄球菌.和肠球菌等细菌侵袭尿道可引起感染。

根据感染部位可分为上尿路感染（输尿管炎和肾盂肾炎）和下尿路感染（膀胱炎和尿道炎）。

常见致病菌：

金黄色葡萄球菌，肠球菌，大肠埃希氏菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，变形杆菌，产气肠杆菌等。

1.标本：

中段尿导尿管尿无菌尿（包括输尿管尿）

2.涂片检查：

无菌操作吸取新鲜尿液5-7ML，离心取沉渣制成涂片，革兰氏染色.镜检，初步报告

3.培养基：

血平板中国蓝平板或巧克力平板

4.培养：

用无菌接种环挑取尿液接种于血平板和中国蓝平板，35℃培养箱孵育18-24小时，如有菌生长，选择相应测试板鉴定报告。

如无细菌生长，继续培养24小时，发出“普通培养无细菌生长”报告。

5.淋病奈瑟氏菌培养：

取尿液沉淀物接种于巧克力平板，如无细菌生长，继续培养48小时，发出“普通培养无细菌生长”报告。

若有小而隆起.湿润.透明的菌落，涂片镜检，鉴定报告。

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2005年06月01日

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第11页共40页

三.呼吸道标本的处理

从呼吸系统感染患者标本中分离出病原菌的机会很多，因此不易正确解释细菌学的结果。

痰及上呼吸道标本常见的病原菌有：

肺炎链球菌.金黄色葡萄球菌.卡他布兰汉氏菌.化脓性链球菌.流感嗜血杆菌.肠杆菌科细菌和假单胞菌属等

1.上呼吸道标本：

取自扁桃体.咽部.鼻腔等的拭子。

下呼吸道标本：

痰液气管吸出液支气管冲洗液

2.涂片检查：

直接涂片镜检，根据低倍镜下的白细胞和上皮细胞数目的多少判定，是否适合做细菌培养。

还可以初步判定是否有病原菌存在。

3.培养基：

血平板中国蓝平板或巧克力平板

4.培养：

用无菌棉拭子取阳性部分涂在血平板和中国蓝平板，再用无菌接种环划线分区。

根据临床培养目的选择其他培养基。

35℃培养箱孵育18-24小时，如有细菌生长，涂片染色，选择相应测试板鉴定报告。

如无致病菌细菌生长，继续培养24小时，再鉴定发出“正常菌群生长”报告。

四.粪便标本的处理

1.原理：

引起腹泻主要有两个原因，一是由内毒素引起，主要包括霍乱弧菌和产毒素性大肠杆菌，大便性状是水样便。

二是有侵袭性细菌引起，主要是志贺氏菌.沙门氏菌等，大便性状是血性和黏液性。

2.标本：

大便肛拭子

3.培养基：

蛋白胨水SS平板4号平板

4.涂片检查：

一般不做涂片检查

5.培养：

①沙门氏-志贺氏菌：

取新鲜阳性粪便接种SS平板，35℃培养箱孵育18-24小时，如无致病菌细菌生长，报告“未检出沙门氏/志贺氏菌”；如有可疑，用相应的诊断血清凝集，鉴定报告。

②霍乱弧菌培养：

取米泔样粪便接种于碱性蛋白胨水，增菌培养6小时后，去表面菌膜移种于4号平板35℃培养箱孵育18-24小时，如无致病菌细菌生长，则报告“未检出O2菌”；如有可疑，用霍乱多价血清凝集，先用生理盐水做对照。

明显凝集为阳性，做生化反应和型鉴定，再送疾控中心进一步确诊

五.脓液标本的处理

化脓及创伤感染标本中可能发现的病原菌可来源于患者体内常居菌或外界入侵细菌。

常见的致病菌是金黄色葡萄球菌.化脓性链球菌.肺炎链球菌.大肠埃希氏菌.铜绿假单胞菌.变形杆菌.粘质沙雷菌等。

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1.标本：

术后切口感染扁桃体脓性肛周脓肿外伤性感染等

2.涂片检查：

涂片直接做革兰氏染色镜检，按镜下所见初步报告结果。

3.培养基：

血平板中国蓝平板

4．培养：

将标本接种于血平板和中国蓝平板，根据临床培养目的选择其它培养基。

35℃培养孵育18-24小时，如有菌生长，涂片染色，选择相应测试板鉴定报告。

如无细菌生长，继续培养24小时，再鉴定发出“普通培养无细菌生长”报告。

六．穿刺液标本的处理

在正常人体中，上述体液均是无菌的，有感染的情况下检出的细菌，应视为病原菌。

常见的病原菌是葡萄球菌属，脑膜炎奈瑟菌.肠球菌.大肠埃希氏菌.肺炎克雷伯菌.假单胞菌属.链球菌等。

1.标本：

脑脊液.胆汁.胸水.腹水.心包液.关节液及鞘膜液等

2.涂片检查：

标本无色透明，离心取沉淀物涂片，如为脓液，可直接涂片，做革兰氏染色和抗酸染色。

3.培养基：

血平板中国蓝平板或巧克力平板

4.培养：

将标本接种于血液增菌液，经35℃培养孵育18-24小时转接血平板和中国蓝平板，根据临床培养目的选择其它培养基和培养方法，35℃培养孵育18-24小时，如有细菌生长，涂片染色，选择相应测试板鉴定报告。

如无细菌生长，继续培养24小时，再鉴定发出“普通培养无细菌生长”报告。

七．生殖道标本的处理

由于微生物广泛分布于自然界，在人体粘膜与外界相通的腔道，如口腔.鼻咽部.肠道及泌尿生殖道，均存在一定数量和一定种类的正常微生物群，称为正常菌群。

由于某种原因破坏了正常菌群内各种微生物之间的相互制约关系，使其在质和量上失去里平衡。

与生殖器官感染有关的常见微生物是表皮葡萄球菌.腐生葡萄球菌.大肠埃希氏菌.肠球菌.奇异变形杆菌.阴道加德纳菌.真菌.支原体等。

1.涂片检查：

直接涂片染色检查，初步报告结果。

2.培养基：

血平板中国蓝平板或巧克力平板支原体测试板

3.培养：

将标本接种于血平板和中国蓝平板或巧克力平板。

根据临床培养目的选择其它培养基和培养方法（如支原体培养.淋球菌培养等），35℃培养孵育18-24小时，如有细菌生长，涂片染色，选择相应测试板鉴定报告。

如无细菌生长，继续培养24小时，再鉴定发出“普通培养无细菌生长”或“培养无支原体生长”等报告

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十、细菌染色法操作程序

目的：

通过染色，在显微镜下可以观察细菌的形态.大小.排列.特殊结构及染色反应，可以初步鉴定。

正确的染色是鉴定细菌重要和普遍应用的技术。

1.革兰氏染色法：

涂片固定——结晶紫染10秒——水洗——碘液染10秒——水洗——酒精脱色20秒——水洗——石碳酸复红染10秒——水洗——待干镜检

2.抗酸染色法：

涂片固定——加石碳酸复红加热蒸汽出现（不能沸腾）5分钟——水洗——盐酸酒精脱色（红色脱落）5分钟——美蓝复染1分钟——水洗——待干镜检-

3.墨汁负染色法：

脑脊液标本与1—2滴墨汁混匀，加盖玻片后镜检

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