实验一糖和蛋白质的理化性质检验.docx
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实验一糖和蛋白质的理化性质检验
实验一糖和蛋白质的理化性质检验
(4学时)
第一部分蛋白质的理化性质
第一节蛋白质的颜色反应
一、实验目的
掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
二、实验原理
蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用,可产生特定的颜色反应,不同蛋白质所含氨基酸不完全相同,颜色反应亦不同。
颜色反应不是蛋白质的专一反应,一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应,因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。
颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。
三、实验器材与试剂
实验器材
1.鸡蛋1个
2.吸管1.0mL(×1)
3.试管1.5cm×15cm(×2)
4.试管架
5.试管夹2个
6.PH试纸(5-7)
7.水浴锅
实验试剂
1.卵清蛋白液:
将鸡(鸭)蛋白用蒸馏水稀释20-40倍,离心,上清液冷藏备用。
2.1%茚三酮溶液:
1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。
3.浓硝酸:
比重1.42。
4.10%NaOH溶液:
10gNaOH溶于蒸馏水,稀释至100mL。
四、实验方法
A.黄色反应
蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)。
遇硝酸可硝化成黄色物质,此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物(苯及苯丙氨酸较难硝化,需用浓硫酸促进之。
反应如下:
操作方法:
于一试管内,置蛋白质溶液10滴及浓硝酸5滴,加热,冷却后再加10%NaOH溶液20滴,观察颜色变化。
B.茚三酮反应
蛋白质与茚三酮共热,则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。
此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。
含有氨基的其他物质亦呈此反应。
亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)与茚三酮反应呈黄色。
操作方法:
取1mL蛋白质溶液置于试管中,加3-5滴茚三酮试剂,加热至沸,即有蓝紫色出现。
注意:
此反应必须在pH5-7进行。
C.双缩脲反应(参考实验)
将尿素加热,两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。
双缩脲在碱性环境中,能与硫酸铜结合成红紫色的络合物,此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似,故能呈此反应(双缩脲反应可用以鉴定蛋白质是否完全水解,及用比色法作蛋自质之定量测定)。
其反应式如下:
操作方法:
1.取少许结晶尿素放在干燥试管中,微火加热,尿素熔化并形成双缩脲,释出之氨可用红色石蕊试纸试之。
至试管内有白色固体出现,停止加热,冷却。
然后加10%NaOH溶液1mL摇匀,再加2滴1%硫酸铜溶液,混匀,观察有无紫色出现。
2.另取一试管,加蛋白质溶液10滴,再加10%NaOH溶液10滴及1%硫酸铜溶液2滴,混匀,观察是否出现紫玫瑰色。
注意:
硫酸铜不能多加,否则将产生蓝色的Cu(OH)2。
此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用,生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+,妨碍此颜色反应的观察。
第二节蛋白质的沉淀反应
一、实验目的
1.熟悉蛋白质的沉淀反应。
2.进一步掌握蛋白质的有关性质。
二、实验原理
多数蛋白质是亲水胶体,当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后,即产生沉淀。
蛋白质沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。
可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子,内部结构改变很小或基本没有改变,仍然保持原来的生物活性,只要消除沉淀因素,沉淀会重新溶解而成原来的胶体溶液。
不可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子,内部结构发生了较大的改变,蛋白质已失去了原来的生物活性,即使沉淀因素消失后,沉淀也不会重新溶解。
三、实验器材与试剂
实验器材
1.试管1.5cm×15cm(×5)。
2.吸管5.0mL(×2),2.0mL(×3),1.0mL(×1)。
3.玻璃漏斗Φ5cm1个。
4.滤纸Φ9cm1张。
实验试剂
1.蛋白质试液:
见蛋白质颜色反应实验中的卵清蛋白液。
2.硫酸铵晶体:
如颗粒太大,最好研碎。
3.饱和硫酸铵溶液:
蒸馏水100mL加硫酸铵至饱和(硫酸的饱和度:
707g/1000mL)。
4.95%乙醇。
5.结晶氯化钠。
6.1%醋酸溶液:
冰醋酸1mL用蒸馏水稀释至100mL。
7.5%鞣酸溶液:
5g鞣酸溶于水并稀释至100mL。
四、实验方法
A.蛋白质盐析作用
向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度,蛋白质即沉淀析出,这种作用称为盐析。
操作方法:
1.取蛋白质溶液4mL,加入等量饱和硫酸铵溶液(此时硫酸铵的浓度为50%饱和),微微摇动试管,使溶液混和静置数分钟,球蛋白即析出(如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵)。
分取一半混合液,加水观察沉淀是否溶解。
2.将混合液的另一半过滤,滤液中加硫酸铵粉末(约0.8g),至不再溶解,析出的即为清蛋白。
再加水稀释,观察沉淀是否溶解。
注意:
(1)应先加蛋白质溶液,然后加饱和硫酸铵溶液;
(2)固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出,勿与蛋白质沉淀混淆。
B.乙醇沉淀蛋白质
乙醇为脱水剂,能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。
操作方法:
取蛋白质溶液1mL,加晶体NaCl少许(加速沉淀并使沉淀完全),待溶解后再加入95%乙醇3mL混匀。
观察有无沉淀析出。
C.生物碱试剂沉淀蛋白质
植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱(或植物碱)。
能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂,如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。
生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀,可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。
操作方法:
取1支试管,加入2mL蛋白质溶液及1%醋酸溶液4-5滴,向一管中加5%鞣酸溶液5~8滴,观察结果。
D.重金属盐沉淀蛋白质(参考实验)
蛋白质与重金属离子(如Cu2+,Ag+,Hg2+等)结合成不溶性盐类而沉淀。
操作方法:
取试管2支各加蛋白质溶液2mL,一管内滴加1%醋酸铅溶液,另一管内滴加1%CuSO4溶液,至有沉淀生成。
第二部分糖的理化性质
第一节糖的颜色反应
A.莫氏试验
一、实验目的
掌握莫氏(Molisch)试验鉴定糖的原理和方法。
二、实验原理
糖经浓无机酸(浓硫酸、浓盐酸)脱水产生糠醛或糠醛衍生物,后者在浓无机酸作用下,能与α-萘酚生成紫红色缩合物。
利用这一性质可以鉴定糖。
三、实验器材与试剂
实验器材
1.棉花或滤纸。
2.吸管1.0mL(×4)、2.0mL(×1)。
3.试管1.5cm×15cm(×4)。
4.水浴锅
实验试剂
1.莫氏试剂:
称取a-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100mL。
此试剂需新鲜配制,并贮于棕色试剂瓶中。
2.1%蔗糖溶液:
称取蔗糖1g,溶于蒸馏水并定容至100mL。
3.1%葡萄糖溶液:
称取葡萄糖1g,溶于蒸馏水并定容至100mL。
4.1%淀粉溶液:
将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物,然后缓缓倾入沸蒸馏水中,边加边搅,最后以沸蒸馏水稀释至100mL。
5.浓硫酸
四、实验方法
于4支试管中,分别加入1mL1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素(棉花或滤纸浸在1mL水中),然后各加莫氏试剂2滴,摇匀,将试管倾斜,沿管壁慢慢加人浓硫酸1.5mL(切勿振摇!
),硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层,观察液面交界处有无紫红色环出现。
注意:
1.一些非糖物质(如糠醛、糖醛酸等)亦呈阳性反应。
此外,样液中如含高浓度有机化合物,将因浓硫酸的焦化作用,而出现红色,故试样浓度不宜过高。
2.亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替a-萘酚,麝香草酚的优点是溶液比较稳定,且灵敏度与萘酚一样。
3.莫氏试剂应直接滴入试液中,勿使试剂接触试管壁,否则试剂会与硫酸接触生成绿色而掩盖紫色环。
B.杜氏试验
一、实验目的
掌握杜氏(Tollen)试验鉴定戊糖的原理和方法。
二、实验原理
戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛,后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质:
本试验虽常用以鉴定戊糖,但并非戊糖特有反应。
果糖、半乳糖和糖醛酸等都呈阳性反应。
戊糖反应最快,通常在45s内即产生红色沉淀。
三、实验器材与试剂
实验器材
1.吸管1.0mL(×1)
2.试管1.5cm×15cm(×3)
3.水浴锅。
实验试剂
1.杜氏试剂:
1%间苯三酚乙醇溶液(2g间苯三酚溶于100mL95%乙醇中)3mL,缓缓加入浓盐酸15mL及蒸馏水9mL即得,临用时配制。
2.1%阿拉伯糖溶液:
称取阿拉伯糖1g,溶于蒸馏水并稀释至100mL。
3.1%葡萄糖溶液:
见试验A。
4.1%半乳糖溶液:
称取半乳糖1g,溶于蒸馏水并稀释至100mL。
四、实验方法
于3支试管中各加入杜氏试剂1mL,再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液,混匀。
各试管同时放入沸水浴中,观察颜色变化并记录颜色变化时间。
C.塞氏试验(参考实验)
一、实验目的
掌握塞氏(Seliwanoff)试验鉴定酮糖的原理和方法。
二、实验原理
酮糖在浓酸的作用下,脱水生成5一羟甲基糠醛,后者与间苯二酚作用,呈红色反应;有时亦同时产生棕色沉淀,此沉淀溶于乙醇,成鲜红色溶液。
以糖为例,其反应如下。
三、实验器材与试剂
实验器材
1.移液管0.5mL(×3),5.0mL(×1)
2.试管1.5cm×15cm(×3)。
3.水浴锅。
实验试剂
1.塞氏试剂:
溶50mg间苯二酚于100mL盐酸中(V(H2O):
V(HCl)=2:
1),临用时配制。
2.1%果糖溶液:
称取果糖1g,溶于蒸馏水并定容至100mL。
3.1%葡萄糖溶液:
见试验A。
4.1%蔗糖溶液:
见试验A。
四、实验方法
于3支试管中分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%果糖溶液各0.5mL,各加塞氏试剂2.5mL,摇匀,同时置沸水浴内。
比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。
注意:
①在此实验条件下,蔗糖有可能水解成果糖与葡萄糖,而呈阳性反应。
葡萄糖与麦芽糖亦呈阳性反应,但呈色反应的速度较酮糖缓慢。
果糖的红色出现及沉淀的产生,应在加热后20-30s内,生成的沉淀能溶于乙醇并成红色溶液。
第二节糖的还原作用
一、实验目的
掌握用糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。
二、实验原理
费林(Fehling)试剂和本尼迪特(Benedict)试剂均为含Cu2+的碱性溶液,能使具有自由醛基或酮基的糖氧化,其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O(由于沉淀速度不同,形成的颗粒大小不同,颗粒大的为红色,小的为黄色。
)此法常用作还原糖的定性或定量测定。
其反应表示如下:
目前临床上多用本尼迪特法,此法具有如下优点:
①试剂稳定,不需临用时配制;②不因氯仿的存在而被干扰;③肌酐或肌酸等物质所产生的干扰程度远较费林试剂小。
三、实验器材与试剂
实验器材
1.移液管1.0mL(×3)、2.0mL(×1)。
2.试管1.5cm×15cm(×3)。
3.水浴锅。
4.试管架。
实验试剂
1.本尼迪特试剂:
称取85g柠檬酸钠(Na3C6H3O7·11H2O)及50g无水碳酸钠,溶解于400mL蒸馏水中。
另溶解8.5g硫酸铜于50mL热水中。
将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中,边加边搅,如有沉淀可过滤。
此混合液可长期使用。
2.费林试剂(参考实验)
试剂A:
称取硫酸铜(CuSO4·5H2O)34.5g,溶于蒸馏水并稀释至500mL。
试剂B:
称取氢氧化钠125g,酒石酸钾钠137g,溶于蒸馏水并稀释至500mL。
临用时将试剂A与试剂B等体积混合。
3.1%淀粉溶液:
将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物,然后缓缓倾入沸蒸馏水中,边加边搅,最后以沸蒸馏水稀释至100mL。
4.1%蔗糖溶液:
称取蔗糖1g,溶于蒸馏水并定容至100mL。
5.1%葡萄糖溶液:
称取葡萄糖1g,溶于蒸馏水并定容至100mL。
四、实验方法
取3支试管,分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL,然后每管加本尼迪特试剂2mL,置沸水浴中加热数分钟,取出,冷却,观察各管的变化。
另于3支试管中加人费林试剂A和B各1mL,混匀,分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL,置沸水浴中加热数分钟,取出,冷却,观察各管的变化(此为参考实验,本实验不做)。
五、实验报告
1.内容与要求:
实验目的、实验原理、主要实验仪器设备与试剂、实验步骤、实验现象、结果分析与讨论。
2.思考题
(1)双缩脲、茚三酮、黄色反应适用鉴别的对象是什么?
(2)什么叫蛋白质的变性?
盐、乙醇、重金属、生物碱沉淀蛋白质反应哪些是可逆反应,哪些是不可逆反应?
(3)莫氏、塞氏、杜氏颜色反应适于鉴别哪类糖?
(4)比较斐林和本尼迪特试剂法有何异同?