生物制药学实验指导.docx

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生物制药学实验指导

实验一细胞色素C的制备及测定

一、实验目的

1．学习细胞色素C的理化性质及其生物学功能。

2．掌握制备细胞色素C的原理。

3．掌握制备细胞色素C的操作技术。

二、实验原理

细胞色素C是呼吸链的一个重要组成成份。

是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。

细胞色素C分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH10.8，分子量为12000～13000道尔顿。

它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。

细胞色素C分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C制成还原型的，氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm，这一特性可用于细胞色素C的含量测定。

由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。

本实验以猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。

三、实验材料

1.实验器材

绞肉机；电磁搅拌器；离心机；72l型分光光度计；玻璃柱（2.5×30cm）；三角瓶；试管（多支，25mL）烧杯（1000、500mL）；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋。

2.实验试剂

⑴2MH2SO4溶液；1MNH4OH溶液；固体硫酸铵

⑵25％硫酸铵溶液:

100mL蒸馏水中含25克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度

⑶0.2％氯化钠溶液：

称0.2克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml.

⑷BaCl2试剂：

称12克BaCl2,溶于100ml蒸馏水中。

⑸20％三氯醋酸溶液

（6）人造沸石

⑺联二亚硫酸钠（Na2S2O4·2H2O）

三、实验操作

1．细胞色素C的制备

⑴材料处理:

取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。

2.提取:

称取绞碎猪心肌肉100克，放人500mL烧杯中，加蒸馏水200ml，以2MH2S04调pH至4.0（此时溶液呈暗紫色），在室温下搅拌提取1小时，在提取过程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。

在即将提取完毕，停止搅拌之前，以1MNH40H调pH至6.0，停止搅拌。

离心3000r/min，10min（或用8层纱布过滤），收集上清液。

残渣加入150mL蒸馏水，再按上述条件提取1小时，两次提取液合并。

3.中和:

用1MNH4OH调上述提取液至pH7.2（此时，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来），静置30～40分钟，收集上层澄清液；将下层悬浮液，离心3000r/min，10min（或纱布过滤），取上清液与前面的液体混合，待上柱。

4.吸附与洗脱:

人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25％的硫酸铵洗脱下来，利用此特性将细胞色素C与其它杂蛋白分开。

具体操作如下：

①人造沸石的预处理：

称取人造沸石约10g，放入500mL烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12秒钟内不下沉的过细颗粒。

②装柱：

选择一个底部带有滤膜的干净的玻璃柱（2.5×30cm），柱中加入蒸馏水至2/3体积，保持柱垂直，然后将己处理好的人造沸石带水装填人柱，注意一次装完，避免柱内出现气泡（约12～15cm）。

③上样：

柱装好后，打开活塞放水（柱内沸石面上应保留一薄层水）将准备好的提取液装入下口瓶，使其通过人造沸石柱进行吸附。

柱下端流出液的速度为1.0ml/分钟。

随着细胞色素C的被吸附，柱内人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为黄色或微红色。

④洗脱：

吸附完毕，将红色人造沸石从柱内取出，放入500mL烧杯中，先用自来水，后用蒸馏水搅拌洗涤至水清，再用100mL0.2％NaCl溶液分三次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清，按第一次装柱方法将人造沸石重新装入柱内，用25％硫酸铵溶液洗脱，流速大约2ml/分钟，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色开始消失时，即洗脱完毕。

人造沸石可再生使用。

⑤人造沸石再生：

将使用过的沸石，先用自来水洗去硫酸铵，再用0.25M氢氧化钠和lM氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，前后用蒸馏水反复洗至pH7～8，即可重新使用。

5.盐析：

为了进一步提纯细胞色素C，在上面收集的洗脱液中，加入固体硫酸铵（按每l00mL洗脱液加入20克固体硫酸铵的比例，使溶液硫酸铵的饱和度为45％）边加边搅拌，放置30分钟后，杂蛋白便从溶液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，离心除去杂蛋白（3000r/min，10min），即得红色透亮细胞色素C溶液。

6．三氯醋酸沉淀：

在搅拌情况向所得透亮溶液加入20％三氯醋酸（2.5mL三氯醋酸/100mL细胞色素C溶液），细胞色素C立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素C属可逆变性），立即于3000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。

加入少许蒸馏水，用玻璃棒搅拌，使沉淀溶解。

7.透析：

将沉淀的细胞色素C溶解于少量的蒸馏水后，装入透析袋，在500mL烧杯中对蒸馏水进行透析除盐（电磁搅拌器搅拌），15分钟换水—次，换水3至4次后；检查透析外液SO42-是否已被除净。

检查方法是：

取2mLBaCl2溶液于试管中，滴加2至3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO4未除净，反之，说明透析完全，将透析液过滤，即得细胞色素C制品。

四、实验结果

含量测定：

所得制品是还原型细胞色素C水溶液，在波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性，用721型分光光度计，先作出一条标准细胞色素C浓度和对应的光密度值的标准曲线，然后根据测得的待测样品溶液的光密度值就可以由标准曲线的斜率求出待测样品的含量。

具体操作如下：

⑴标准曲线的绘制：

浓度为横坐标，A为纵坐标。

标准曲线方程为：

y=1334.2A+6.527

（y表示浓度，单位：

ug/ml；A为吸光度）]。

⑵样品测定

取0.4mL待测样品，用水稀释至10mL，取1mL稀释液加3mL水，加少许连二亚硫酸钠，摇匀，测A520nm.根据标准曲线计算其浓度。

五、注意事项

1．尽可能除掉猪心中的韧带、脂肪和积血。

2．使用离心机之前，一定要配平。

3．透析之前要检查透析袋。

4．在520nm处测得各管的光密度时，要加少许联二亚硫酸钠作还原剂。

六、思考题

1．制备细胞色素C通常选取什么动物组织?

为什么？

2．本实验采用的酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素及含量测定，各是根据什么原理?

3．请说出其它提取和纯化细胞色素C的方法吗？

请写出相关的方法及原理。

实验二茶叶中咖啡因的提取、纯化与鉴定

一、实验目的

1.学会从茶叶中提取咖啡因的基本原理和方法，了解咖啡因的一般性质。

2.掌握用索氏提取器提取有机物的基本原理和方法。

3.掌握用旋转蒸发仪进行浓缩的基本原理和方法。

4.巩固萃取，蒸馏和升华的操作。

二、实验原理

咖啡因属于生物碱类，为嘌呤的衍生物，其化学名称为1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，其结构式与茶碱，可可碱类似。

嘌呤（Purine）     咖啡因（Caffeine）         茶碱（Guanine）     可可碱（Adenine）

纯品咖啡因为白色针状结晶体，无臭，味苦；易溶于水、乙醇、氯仿、丙酮；微溶于石油醚；难溶于苯和乙醚。

它是弱碱性物质，水溶液对石蕊试纸呈中性反应。

咖啡因在100℃时即失去结晶水，并开始升华，120℃时升华相当显著，至178℃时升华很快。

无水咖啡因的熔点为234.5℃。

茶叶中含有多种生物碱，其主要成分为含量约1～5%的咖啡因，并含有少量茶碱和可可豆碱，以及11～12%的单宁酸（又名鞣酸），还有约0.6%的色素、纤维素和蛋白质等。

为了提取茶叶中的咖啡因，往往利用适当的溶剂（如氯仿、乙醇、苯等）在脂肪提取器中连续萃取，然后蒸出溶剂，即得粗咖啡因。

粗咖啡因中还含有一些生物碱和杂质，利用升华法可进一步纯化。

三、主要仪器与试剂

仪器：

索氏提取器、旋转蒸发仪

试剂：

1、碘一碘化钾试剂：

1g碘及10g碘化钾溶于50ml水中，加2ml醋酸，再用水稀释至100ml摇匀，贮于棕色瓶中。

2、 5% 鞣酸溶液：

鞣酸0.5g用1ml乙醇溶解后，加水至10 ml 。

四、实验步骤

1. 咖啡因的提取 

称取20g干茶叶， 装入滤纸筒内（或者用纱布包装）， 轻轻压实， 滤纸筒上口塞一团脱脂棉， 置于抽提筒中， 圆底烧瓶内加人 200ml甲醇， 加热甲醇至沸， 连续抽提1h，待冷凝液刚刚虹吸下去时， 立即停止加热。

2. 浓缩与粗提物干燥

提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至2ml左右，回收溶剂（甲醇）。

用胶头滴管吸出至蒸发皿中，加入4g 生石灰粉， 搅拌均匀， 酒精灯上加热 蒸发至干， 除去全部水分。

冷却后， 擦去沾在边上的粉末， 以免升华时污染产物。

3. 咖啡因的升华

将一张刺有许多小孔的圆形滤纸盖在蒸发皿上， 取一只大小合适的玻璃漏斗罩于其上， 漏斗颈部疏松地塞一团棉花。

用酒精灯小心加热蒸发皿， 慢慢升高温度， 使咖啡因升华。

咖啡因通过滤纸孔遇到漏斗内壁凝为固体， 附着于漏斗内壁和滤纸上。

当纸上出现白色针 状晶体时， 暂停加热， 冷至 100 ℃左右， 揭开漏斗和滤纸， 仔细用小刀把附着于滤纸及漏斗壁上的咖啡因刮入表面皿中。

将蒸发皿内的残渣加以搅拌， 重新放好滤纸和漏斗， 用较高的温度再加热升华一次。

此时 ，温度也不宜太高， 否则蒸发皿内大量冒烟， 产品既受污染又遭损失。

合并两次升华所收集的咖啡因， 测定熔点。

4.咖啡因的鉴定 

（1） 与生物碱试剂：

取咖啡因结晶的一半于小试管中， 加 2ml水， 微热， 使固体溶解。

分装于2 支试管中， 一支加入1～2 滴 5% 鞣酸溶液， 记录现象。

另一支加 1～2 滴 10% 盐酸 （ 或 10% 硫酸 ）， 再加入 1～2 滴碘一碘化钾试剂， 记录现象。

（2） 氧化：

 在表面皿剩余的咖啡因中， 加入30%H2O28～10滴， 置于水浴上蒸干， 记录残渣颜色。

再加一滴浓氨水于残渣上， 观察并记录颜色有何变化。

五、注意事项

1、索氏提取器的虹吸管极易折断，搭装装置和拿取时必须特别小心。

2、用滤纸包茶叶末时要严实，防止茶叶末漏出堵塞虹吸管；滤纸包大小要合适，既能紧贴套管内壁，又能方便取放，且其高度不能超出虹吸管高度。

3、浓缩萃取液时不可蒸得太干，以防转移损失。

否则因残液很粘而难于转移，造成损失。

4、升华过程中要控制好温度。

温度太低，升华速度较慢，温度太高，易使产物发黄（分解）。

5、刮下咖啡因时要小心操作，防止混入杂质。

六、思考题

1.升华方法适应哪些物质的纯化？

如何改进升华的实验方法？

2.加入生石灰粉的作用是什么？

实验三β-胡萝卜素提取分离与测定

一、背景介绍

β-胡萝卜素的分子式是C40H56，分子量为536.88。

其稀溶液呈黄色，浓度增大时带橙色，因溶液的极性可稍带红色，遇氧气、热和光不稳定，在弱碱下稳定，不溶于水、丙二醇、甘油、酸和碱，溶于二硫化碳、苯、氯仿、已烷及植物油，几乎不溶于甲醇和乙醇。

β-胡萝卜素属脂溶性维生素A原的一种，是一种抗氧化剂，可清除氧自由基，抑制自由基生成。

具有促进免疫细胞增殖、增强免疫细胞功能的作用。

因此，β-胡萝卜素可有效防治肿瘤、癌症、心脏病及冠心病。

并且，β-胡萝卜素本身无毒，当大量摄入时，在体内可积累但不引起中毒。

二、实验目的

1、学习从天然产物中提取有机化合物的方法。

2、学习用薄层层析法检验有机化合物的基本原理，点样，展开和计算Rf值的方法。

三、仪器和试剂

仪器：

铁架台、三角瓶4个/组（50ml）、分液漏斗（150ml）、蒸馏瓶（50ml）、漏斗、色谱柱、硅胶薄层板、量筒、烧杯、层析缸（用烧杯代替）、点样毛细管、研钵（或者用匀浆机代替）、表面皿。

试剂：

胡萝卜、丙酮、石油醚（bp30~60℃）、硅胶（层析用，200~300目）、无水硫酸钠、石油醚（bp60~90℃）、石英砂。

四、实验方案

1、含类胡萝卜素石油醚溶液的制备

将新鲜胡萝卜洗净、擦干，切去尾部，切碎。

称取碎鲜胡萝卜10g于小研钵中，研碎（或用匀浆机匀浆），加入0.5mL氨水和3.5mL乙醇。

碎胡萝卜移至50mL三角烧瓶中，每次用丙酮10mL萃取2次，再用石油醚（bp30~60℃）萃取固体两次，每次10mL。

把石油醚溶液加到丙酮液中。

在分液漏斗中将混合液与50mL饱和氯化钠溶液振荡，分去下层，用蒸馏水洗涤上层液两次，每次50mL，分去水，用无水硫酸钠干燥石油醚液（约1h），把混合液倒入50mL圆底烧瓶中，热水浴加热蒸馏，除去溶剂，得固体（没有旋转蒸发仪则直接在水浴锅上加热挥发干溶剂）。

在制得的固体物加入3mL石油醚（bp60~90℃）拌硅胶1g，在通风橱内抽干，得黄色硅胶颗粒，待上柱。

2、装柱和分离

取20cm*1cm色谱柱一根，垂直装置，以50ml三角烧瓶作洗脱液的接受器。

关闭活塞，向柱内倒入石油醚（bp60－90℃）至约为柱高的3/4处，打开活塞，控制流出速度为1滴/s。

通过一干燥的玻璃漏斗慢慢加入层析硅胶。

用洗耳球轻轻敲打柱身，使填装紧密。

当装填到1/2时，在上面加一层0.5cm厚的石英砂，操作时一直保持上述流速，注意不能使液面低于砂子的上层。

当液面流至离海石砂面1cm时，关闭柱子活塞。

立即从玻璃漏斗加入已制备好的含胡萝卜素的黄色硅胶，随后用0.5ml石油醚洗下管壁的硅胶，如此连续2—3次，直至洗净为止。

然后用石油醚（bp60－90℃）作洗脱剂进行洗脱，洗3滴/s。

当有一黄色的谱带分出，待黄色组分绝大部分洗出时，把洗脱剂换成1：

9（V/V）丙酮一石油醚（bp60－90℃）混液作洗脱剂进行洗脱，控制流出速度如前（这混液洗脱剂有助于混合物中极性较大的组分移动），又可分出两个黄色组分。

在45—90min内，柱中物料将全部洗脱出来。

观察这些物料通过柱子的移动情况。

在三角烧瓶中收集3份洗出液，然后用薄层色谱对各段洗出液进行色谱分析。

3.薄层色谱法

样品：

柱色谱法中洗脱出的份样品液

展开剂：

1：

9（V/V）丙酮一石油醚溶液

点样：

取出上述制好的薄层板，分别在距一端点1cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。

用毛细管吸取少量样品液，在一块板的起点线上点第一个色带的样品液，根据柱色谱分离的色带，依次点样，如果样点颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须待前次样点挥干后进行。

样点直径不超过2mm。

展开：

待样点干燥后，小心地放入已加入展开剂的250ml广口瓶中进行展开。

在瓶的内壁贴一张高5cm，环绕周长4/5的滤纸，下面浸入展开剂中，以使容器内被展开剂蒸气饱和。

点样一端浸入展开剂0.5cm（样点不浸泡在展开剂中）。

盖好瓶塞，观察展开剂前沿上升离板的上端1cm处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，晾干后，量出展开剂和样点移动的距离，计算Rf值。

五、注意事项

1，本实验采取的工艺不同于其他工艺，体现在原料粉碎时加入了稳定剂（5ml氨水和35ml乙醇）来防止β－胡萝卜素被氧化，由此可提高提取率。

2、色谱柱填装紧密与否，对分离效果很有影响。

若柱中留有气泡或各部分松紧不匀（更不能有断层或暗沟）时，会影响渗滤速度和显色的均匀。

但如果填装时过分敲击，又会因太紧密而流速太慢。

3、加入石英砂的目的是。

在加料是不致把吸附剂冲起，影响分离效果。

4、为了保持色谱柱的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶液或溶液中是必要的。

否则当柱中溶液流干时。

柱身干裂，影响渗滤和显色的均一性。

5、若不用滴液漏斗，也可用每次倒入10ml洗脱剂的方法进行洗脱

6、点样用的毛细管必须专用，不得弄混。

7、点样时，使毛细管液面刚好接触到薄层（滤纸）既可，均匀点样过重而使薄层破坏。

实验四银耳多糖的制备与分析

一、实验目的

1、了解银耳多糖制备的基本原理。

2、掌握糖类物质提取的基本操作技术。

二、实验原理

银耳是真菌的一种，是我国传统的珍贵药材之一，具有滋阴润肺、益胃生津等功效。

常用于治疗虚劳咳嗽、阴伤燥咳、虚热口渴等症。

银耳多糖是银耳的主要药效成分，银耳中含有的多糖类物质则具有明显提高机体免疫功能，抗炎症和抗放射等作用。

1、制备（提取）原理：

银耳多糖易溶于水，但不溶于乙醇。

因此本实验采用沸水抽提、氯仿-正丁醇法除蛋白和乙醇沉淀分离制得银耳多糖粗品。

然后再进行定性分析。

2、分析（鉴定）原理：

Molish反应

多糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下，脱水形成糠醛及其衍生物，其与α-萘酚反应，作用生成紫色的化合物。

原理是羰基与酚类进行了缩合，这样，糖与浓酸作用后，再与α-萘酚反应，就能生成紫色的化合物。

因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有无糖的存在。

斐林试剂反应

质量浓度为0.1g/mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05g/mL的硫酸铜溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的氢氧化铜沉淀。

氢氧化铜与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成砖红色的氧化亚铜沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。

用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化为：

浅蓝色棕色砖红色（沉淀）。

三、实验试剂和器材

1、银耳子实体2、乙醇3、乙醚4、丙酮

5、Sevag试剂：

氯仿：

正丁醇=5:

1

6、Molish试剂：

取5gα-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配置，棕色瓶保存。

7、斐林试剂：

甲液质量浓度为0.1g/mL的氢氧化钠溶液

乙液质量浓度为0.05g/mL的硫酸铜溶液

临用时临时配置，将4～5滴乙液滴入2mL甲液中，配完后立即使用。

仪器和器材

烧杯、试管、分液漏斗、容量瓶、电炉、石棉网、纱布、离心机、真空干燥箱、电子天平

四、实验步骤

（一）制备步骤

1、取银耳子实体10g加水300mL，直火提取1h，提取过程中不断用玻棒搅拌。

双层纱布过滤，提取液浓缩至100mL左右。

2、浓缩液加入等体积的Sevag试剂去蛋白，3000rpm离心10min。

3、上清液加入3倍95%乙醇，搅拌均匀后，3000rpm离心10min（或静止1h）。

4、沉淀用无水乙醇洗涤2次，乙醚洗涤1次，真空干燥，得因而多糖粗品。

（二）分析步骤

1、称取银耳多糖粗品20mg，加水溶解并定容至100mL，作为样品制备溶液供试。

2、Molish反应

取试管，加入多糖溶液1mL，然后加入两滴Molish试剂，摇匀。

倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。

用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。

3、斐林试剂

取试管，将4～5滴乙液滴入2mL甲液中。

摇匀后，分别加入4滴待测糖溶液，置于沸水浴中加热2～3min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。

实验五葡聚糖凝胶层析

一、实验目的：

1．掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理；

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

二、实验原理 

凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。

层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：

具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。

葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。

凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。

可分离的分子量范围从几百到几十万不等。

     葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。

分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。

若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。

本实验以葡聚糖凝胶G-50作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖-2000和溴酚蓝。

蓝色葡聚糖-2000分子量接近2×106， 而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。

三、实验材料：

1.实验器材 层析柱（1×20cm）附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶（带下口的三角瓶，250m1）；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计 

2.实验试剂 

（1） Tris-醋酸缓冲液（pH7.0）:

取0.0lmol/L Tris溶液（含0.1mol/L KCl）900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。

（2） 溴酚蓝溶液：

称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris-醋酸缓冲液（pH7.0）至溶液呈深蓝色。

（3） 蓝色葡聚糖-2000溶液：

称取蓝色葡聚糖-2000  10毫克，溶于2毫升Tris-醋酸缓冲液（pH7.0）中即成。

（4） 样品溶液：

取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖-2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。

   （5）葡聚糖凝胶G-50 （Sephadex-G-50） 

四、实验操作：

1.实验凝胶的制备：

商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G-50，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀 2小时，一般采用后一种方法。

再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液（pH7.0的Tris-醋酸溶液）洗涤2-3次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。

2.装柱：

将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。

层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，最后保留约2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。

将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。

装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。

再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。

平衡后，拧紧下端螺旋夹。

3.加样品：

打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。

取溴酚蓝及蓝色葡聚糖-2000混合液0.3毫升，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。

打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。

当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。

用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。

最后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为3-4cm。

4.洗脱与收集：

连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱。

仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升即换一支收集管（试管预先编号），收集约20管左右，样品即可完全被洗脱下来。

将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长5