微量法测定抗氧化活性模型的研究.docx
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微量法测定抗氧化活性模型的研究
微量法测定抗氧化活性模型的研究
（食品科学系）
1引言
1.1抗氧化剂的应用情况
随着国民经济的发展和人民生活水平的提高，食品生产和加工保存中，食品保鲜越来越受到重视。
为达到食品防腐、保鲜、延长保质期和货架寿命的目的，常采用冷藏和辐射保鲜技术，但最为方便和经济的技术是采用食品添加剂。
其中食品抗氧化剂在食品中使用极为普遍[1]。
食品在储存、加工和流通过程中，食品中的油脂类组分易受空气中O2的氧化作用引起变色或变味并会生成有害物质，特别是油脂和富脂食品常因氧化而酸败。
添加抗氧化剂可防止食品成分氧化变质，近半个世纪以来，在油脂和富脂食品中加入抗氧化剂以抑制或延缓食品在加工或流通储存过程中氧化变质已成为食品加工中的重要手段。
食品抗氧剂分为人工合成和天然的两大类。
抗氧化剂在中国食品添加剂中是第四类，在食品抗氧化剂的发展中有数以百计的天然或合成化合物要进行抗氧化功能及安全性的评价。
目前，我国食品工业主要使用的是人工合成抗氧化剂，如TB、HQ、BHT、PG等，但因为这些抗氧化剂都具有较大的潜在毒性，而逐渐被限制使用。
使用高效、安全、无毒、纯天然的抗氧化产物是目前国际食品界的主旋律[1]。
食品中使用的抗氧化剂的抗氧化能力需经过准确的评价，特别是对于抗氧化能力未知的天然的抗氧化产物，这是关系到食品质量与安全的重要控制环节。
因此建立一种用于天然产物的批量快速筛选的抗氧化能力评价的方法是非常必要的。
1.2天然产物抗氧化活性的评价方法
目前用于评价天然产物抗氧化能力的方法已有很多，如硫氰酸盐法、硫代巴比妥酸法、ORAL法、DPPH法等。
这些方法存在一定的优势，但同时操作繁琐、费时、所需试剂或大型仪器的费用昂贵[1]。
DPPH法是目前研究和使用最频繁的一种评价天然产物抗氧化能力的方法。
此法用于天然产物的批量抗氧化能力的筛选具有操作快速、准确且稳定、可靠的特点。
此法于1958年被提出，广泛用于测定生物试样、分类物质和食品的抗氧化能力。
此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成剂量关系，通过检测样品对DPPH自由基的清除能力，可以表示其抗氧化性的强弱[2][3][4]。
1.3本课题的研究方法和意义
运用目前最受推崇的评价天然产物的抗氧化性的方法结合分光光度计的DPPH法具有操作快速、结果稳定及可靠的特点，但此法还存在一些不尽人意的缺点，如样品消耗量大、操作繁琐，并且该方法的准确性、灵敏度尚未有文献系统的研究[2]。
随着精密实验仪器的逐渐普及，食品实验中的分析实验也跟着发生了同步的更新。
基于这些原因，本文探究运用酶标仪和微孔板的微孔板法代替分光光度法，即以儿茶素为实验对象，将酶标仪和微孔板运用于DPPH法中，并通过正交试验从可能的结果中筛选出能快速、准确地对天然产物的抗氧化性进行评价，并且使样品使用量小、结果稳定可靠的检测方法，根据确定出的最适合因素水平建立出模型。
最后，通过验证实验对该模型进行深度的考量。
2材料与方法
2.1实验仪器
酶标仪9602G
北京艾普公司
96微孔板
北京仕德博创科技有限公司
GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱
上海博讯实业有限公司
FA2004N电子分析天平
上海精科仪器
移液枪（10-100µl、100-1000µl）
大龙医疗设备有限公司
2.2实验材料与试剂
DPPH﹒自由基
博美科生物科技有限公司
儿茶素（Catechin）标准品
SbaseBitCorporation
无水乙醇、维生素A、E、C皆为天津市化学试剂三厂生产的分析纯
2.3实验方法
2.3.1单因素对抗氧化模型建立的影响
查阅有关文献[3]，可知在本实验条件下DPPH的较大吸收峰在485～510nm，本实验选用的酶标仪为固定波长选用型，依据光谱吸收图反映的吸收峰特征，酶标仪490nm检测波长也是DPPH的主要吸收峰所在波长，可以作为其光密度的检测波长。
2.3.1.1DPPH浓度的考察
选择DPPH（乙醇溶液）浓度为300µmol/L，250µmol/L，200µmol/L，150µmol/L，100µmol/L和50µmol/L。
把0.5mg/mL儿茶素（乙醇溶液）10µL加入到96微孔板中，加入150µLDPPH溶液，避光反应25min后，酶标仪490nm处测定光密度OD值。
2.3.1.2DPPH加入量的考察
选择浓度为250µmol/L的DPPH（乙醇溶液）250µl、225µl、200µl、175µl、150µl、125µl、100µl和75µl，把0.5mg/mL儿茶素（乙醇溶液）10µL加入到96微孔板中，避光反应25min后，酶标仪490nm处测定光密度OD值。
2.3.1.3反应时间的考察
选择250µmol/L的DPPH加入量为125µl，把0.5mg/mL儿茶素（乙醇溶液）10µL加入到96微孔板中，从加入儿茶素后每隔1分钟酶标仪490nm处测定光密度OD值（n=5），持续8分钟。
2.3.1.4光线的影响
把儿茶素配置成0.5mg/mL的乙醇溶液，对半稀释5个浓度。
把系列浓度的儿茶素溶液各10µl加入到96微孔板中，然后分别加入125µl250µmol/L的DPPH溶液，避光反应25min后，在490nm处测定光密度值OD（n=5）；不避光情况下进行相同的实验操作。
2.3.2正交试验
正交试验设计是使用正交表来安排多因素、多水平试验，并采用统计学方法分析实验结果，并对试验结果进行计算分析，最终达到减少试验次数、缩短试验周期，迅速找到优化方案的一种实验设计方法[8]。
这种方法在改进产品质量、优化工艺条件及研发新产品等诸多方面广泛应用。
本实验选定IC50，即DPPH清除率为50%时所需抗氧化剂浓度为正交试验的指标；选定DPPH浓度、DPPH加入量和反应时间为本实验的因素；按照单因素试验结果确定各个因素的水平，并设置因素水平表；选用对应的正交表并进行试验，即为L9（34）正交表；最后从分析试验结果找到最佳方案并建立抗氧化模型。
IC50的定义是DPPH清除率为50%时所需抗氧化剂浓度。
将配制好的儿茶素乙醇溶液（0.5mg/mL）对半稀释成5个浓度，分别把10µl不同浓度的儿茶素乙醇溶液加入到96微孔板中，再加入100µl300µmol/L的DPPH乙醇溶液，平行3组,同时以10µl无水乙醇代替待测液做空白对照，反应25min后，用酶标仪在490nm处测定OD值。
DPPH清除率的计算公式
（1）：
Ai——加入待测液时DPPH乙醇溶液的吸光值；
Af——未加入待测液时DPPH乙醇溶液的吸光值；
得到DPPH的清除率后，根据不同浓度抗氧化剂的清除率（20%-80%）作曲线或用SPSS软件处理得出IC50值。
2.3.3验证实验
根据正交试验确定的最适实验条件，验证该模型：
以儿茶素为研究对象，对微量法与分光光度法进行比较，验证其可行性；以维生素A、维生素C和维生素E为对照，分别用微量法和分光光度法对维生素A、维生素C、维生素E和儿茶素进行抗氧化活性测定，结果用TAC表示，验证该模型的准确性。
其中，TAC为总抗氧化能力值（totalantioxidativecapacity），即每毫升的样品液所能清除DPPH的微克数。
（2）
A——IC50对应清除的DPPH的量；
B——定容体积。
3结果与分析
3.1单因素考察结果
3.1.1DPPH浓度对儿茶素抗氧化性测定的影响
以DPPH浓度C（µmol/L）为横坐标，光密度值OD的为纵坐标绘制曲线，见图1。
图1DPPH浓度与OD值关系
参阅相关文献，DPPH的浓度一般在50~300µmol/L之间，所以选定上图的6个浓度进行研究。
由图1可以看出，OD值随DPPH浓度的增大而增大，二者成正相关，标准曲线方程为：
y=0.0004x+0.0687，相关系数r=0.9907。
说明DPPH浓度是影响儿茶素抗氧化活性的重要因素。
3.1.2DPPH加入量对儿茶素抗氧化性测定的影响
以DPPH加入量V（µl）为横坐标，光密度值OD的平均值为纵坐标绘制曲线，见图2。
图2DPPH加入量与OD值关系
参阅相关文献在100~250µl之间设置了7个水平进行研究。
由图2可以看出，OD值随DPPH加入量的增大而增大，二者呈正相关。
相关系数r=0.9985，说明DPPH加入量是影响儿茶素抗氧化活性的重要因素，在该反应体系中改变DPPH加入量，OD值就相应地呈线性改变。
3.1.3反应时间对儿茶素抗氧化性测定的影响
从加入儿茶素后每隔1分钟测定（n=5）一次OD值，持续12分钟左右，得到12个数据点，以这12个反应时间t（秒）为横坐标，光密度值OD的平均值为纵坐标绘制曲线，见图3。
图3反应时间对OD值的影响
对上图进行分析。
本文首先，尝试着对这12个点进行拟合，可是最后发现并没有合适的标准曲线能较好的覆盖这12个实验点的，且拟合出来的相关系数都不尽人意，所以本文做了下面的处理。
取图3前面的7个数据点（即前7分钟测定的数据点），以反应时间t（秒）为横坐标，光密度值OD的平均值为纵坐标做曲线，用SPSS13.0软件进行拟合，见图4。
图4反应时间对OD值的影响
从上图可知，相关系数R=0.9962，说明反应时间也是影响儿茶素抗氧化活性的重要因素。
而图3中最后的5个点大致成水平，这说明在反应体系不变的情况下，随着反应时间的延长，儿茶素与DPPH反应越来越充分，OD值越来越来小，当二者反应完全时，OD值就固定不变了，即曲线趋于水平。
反应体系在前7分钟内OD值迅速下降，而7分钟之后，随着反应体系的反应趋于充分，OD值就不在下降了。
这是因为反应体系的反应趋于充分了，这时OD值就不在下降了。
3.1.4光线对儿茶素抗氧化性测定的影响
以光密度值OD值的平均值为横坐标，儿茶素浓度C为纵坐标绘制曲线，见图5。
图5光线对儿茶素抗氧化性测定的影响
本实验在避光和不避光两种实验条件下，进行相同的操作，来考察光线的影响。
由图5可以看出不避光时OD值较小，说明光线可以加速儿茶素对DPPH自由基的清除。
用SPSS13.0软件进行PairedSamplesTTest，得P值为0.236，说明这两种实验条件下测定的OD值不存在显著性差异（P=0.236＞0.05），即光线对实验结果的有影响但不是很明显，且考虑到被测物在光线照射的分解作用[8]，为了保证测定的准确性，本文确定所有反应在避光条件下进行。
3.2正交试验结果及模型的建立
3.2.1因素水平的设置
按照单因素试验结果，选择DPPH浓度、DPPH加入量和反应时间为主要因素，并设置各个因素的水平，结果见下表2。
表2因素水平的设置
水平
因素
DPPH浓度（µmol/L）
A
DPPH加入量（µl）
B
反应时间（min）
C
1
200
175
15
2
150
150
25
3
100
125
35
3.2.2正交试验的分析及模型的建立
从因素水平表看，为3因素3水平，所以选用L9（34）正交表。
3个因素按顺序占2、3、4列，表中K1、K3、K2分别为水平1、2、3的均值，R为各个因素三个水平的极差。
试验得到各个实验组的IC50，并运用SPSS13.0计算出K值、R值，并进行了方差分析，结果见表2和表3。
表3正交试验设计及结果
试验号
因素
IC50（µg/ml*100）
A
B
C
1
1
1
1
14.97
2
1
2
2
16.31
3
1
3
3
13.63
4
2
1
2
17.15
5
2
2
3
18.53
6
2
3
1
20.54
7
3
1
3
23.58
8
3
2
1
27.74
9
3
3
2
28.11
K1
14.97
19.95
24.98
K2
18.74
27.23
20.52
K3
26.15
20.74
17.39
R
11.18
7.28
7.59
表4方差分析表
方差来源
平方和
自由度
F值
P值
A
0.089
2
0.005
0.001
B
0.138
2
0.008
0.072
C
87.406
2
4.805
0.018
可知，极差越大的因素重要程度越高。
由表2的极值R可知，各因素影响顺序是A＞C＞B，说明DPPH浓度是重要因素，反应时间和DPPH加入量次之。
由表3可知，因素A有极其显著的影响（P=0.001＜0.01），最佳水平为A3。
因素B显著性不明显（P=0.072＞0.05），为了节省样品，取B3。
因素C对结果的影响显著（P=0.018＜0.05），结合实验操作所需，考虑到反应体系的反应完全性，取单因素考察的最佳水平C2。
故最佳实验条件为：
A3B3C2，即DPPH的浓度为100µmol/，加入量为125µl，避光条件下反应25min。
3.4验证实验结果
为了更好的把微量法测抗氧化活性模型应用于实践，对上述此模型中的参数进行验证实验，以获得模型的稳定性和准确性，本文进行了重复实验和实际样品对照实验。
稳定性实验RSD为3.20%，表明结果稳定可靠。
3.4.1微量法与分光光度法的比较
以儿茶素为研究对象，以IC50和TAC作为考察指标，进行微量法和分光光度法的比较，结果见表5。
表5微量法与分光光度法比较
实验方法
IC50
TAC
相关系数R
显著性值P
微量法MPA
14.45
428.67
0.9984
0.524
14.23
429.34
14.67
430.01
分光光度法SPM
2.99
429.32
3.05
430.00
3.11
428.70
由表5可知，微量法得到的IC50值约是分光光度法的4.7倍，但用TAC表示则基本消除了因体系引起的差异，两种方法得到的TAC值一致。
两种方法测得的儿茶素的TAC的相关系数R=0.9984，显著性值P=0.524。
表明微量法和分光光度法之间存在高相关性，不存在显著性差异，可以应用在微量天然产物的体外筛选体系中。
3.4.2维生素系列对照实验
以维生素A、维生素C和维生素E为对照，分别用微量法和分光光度法对维生素系列和儿茶素进行抗氧化活性测定，结果用IC50和TAC表示，验证该模型的准确性。
结果见表6。
表6对照实验结果
样品
Sample
IC50（µg/ml*100）
TAC（µg）
微量法
分光光度法
微量法
分光光度法
MPA
SPM
MPA
SPM
维生素A
5.07
1.07
49.54
50.04
维生素E
2.48
0.54
98.12
101.01
维生素C
8.76
1.81
189.23
187.93
儿茶素
14.45
3.05
429.34
430.11
从IC50来看，这些被检测物的抗氧化活性由强到弱的顺序为儿茶素＞维生素C＞维生素E＞维生素A，这与实际是相符的。
从TAC来看，TAC消除了反应体系不同的影响，微量法得到的结果和分光光度法得到的结果是一致的，且跟实际都是相符的。
所以，可以说明微量法测定抗氧化活性模型是准确、可靠的。
4讨论
4.1反应时间对OD值的影响
对于反应时间对OD值的影响还存在值得讨论的地方。
从上文可知，在反应体系不变的情况下，随着反应时间的延长，儿茶素与DPPH反应越来越充分，OD值越来越来小，当二者反应完全时，OD值就固定不变了，反应在图形上就是曲线趋于水平。
反应体系在前8分钟内OD值迅速下降，而8分钟之后，随着反应体系的反应趋于充分，OD值就不在下降了。
这是因为反应体系的反应趋于充分了，这时OD值就不在下降了。
为了验证上面的说法本实验加大了反应时间的范围（0-120min）进行验证。
从结果可知，反应体系在前10分钟内OD值迅速下降，而10分钟之后，随着反应体系的反应趋于充分，OD值就不在下降了，这与上面的假设相符。
为了消除儿茶素浓度的影响，进一步证明前面的假设，本文进一步进行了验证。
选三个不同浓度的儿茶素的浓度（0.125mg/ml、0.25mg/ml和0.5mg/ml），在120min内每个10钟测定一次OD值。
可知，在10分钟前，不同浓度的儿茶素的OD值呈大幅下降趋势，随着反应体系的反应趋于充分，10分钟后接近平稳。
所以可以确定只要反应时间大于10分钟，此模型就可以保证准确性。
4.2试验过程中是否避光的影响
本文前面在避光和不避光两种实验条件下对光线是否对实验结果产生影响进行了研究，从结果可知光线可以加速儿茶素对DPPH自由基的清除，但从t检验可知光线对实验结果的有影响但不明显。
由此我们本可以选择在不避光的条件下进行实验的，但考虑到在光线照射下某些物质是易分解的，如：
维生素C、茜素等[4]。
这会使实验结果缺乏准确性，为了尽可能的扩大本模型的适用性，在建立模型时尽可能的在避光条件下进行。
4.3正交试验水平设置的问题
根据正交实验的分析结果可知，三个因素对结果的影响由强到弱的顺序为：
DPPH浓度＞反应时间＞DPPH加入量（根据R值大小可得）。
为了使建立出来的模型尽可能接近最适条件，我们应该根据各因素对结果影响的强弱来设置其上下浮动值的大小，即因素对结果的影响越强，上下浮动值就应该越小；因素对结果的影响越弱，上下浮动值就可以相应的小一些，并且可以相应的增加几组因素的水平设置，这是本文值得优化的地方。
5结论
（1）利用酶标仪，以具有DPPH自由基清除活性的化合物儿茶素为研究对象，分别对DPPH浓度、DPPH加入量和反应时间这3个影响因素进行单因素考查，得出这三个因素都是影响儿茶素抗氧化活性的重要因素。
由各单因素图可知，达到测定儿茶素抗氧化活性最适条件是在DPPH浓度为150µmol/L、DPPH加入量为150µl、反应时间为25分钟。
（2）在单因素分析的基础上，建立L9（34）正交试验，对正交试验结果进行直观分析和方差分析，确定最适的实验条件，从而建立起适合天然产物杭氧化活性快速筛选的方法。
（3）为对微量模型中的参数进行验证实验，以获得模型的稳定性和准确性，本文进行了重复实验和标准品对照实验。
以RSD的结果来判定模型的稳定性。
通过微量法与分光光度法的对照，以维生素A、维生素C和维生素E为对照品，比较其IC50和TEC,对两种方法的相关性做t检验，证明该模型准确可行。
最终建立起一个结合了酶标仪和96孔板的DPPH抗氧化微量筛选模型，能快速、准确地对天然产物单体化合物的抗氧化性进行筛选，并且使样品使用量小、结果稳定可靠。
【参考文献】
[1]李涛,余叙亚等.抗氧化剂的研究与应用现状[J].食品研究与开发,2003,24
（2）:
23-26.
[2]许启泰,王丽等.茜素抗氧化活性的影响因素[J].河南大学学报（医学版）,2008,27（3）:
32-34.
[3]彭长连,陈少薇等.用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力[J].生物化学与生物物理进展,2000,27（6）:
658-662.
[4]林诗云，冯桂全等.天然药提取物清除自由基和抗氧化活性研究[J].云南民族大学学报（自然科学版）,2010,19
（1）:
204-207.
[5]唐勇,赵靖等.植物总抗氧化能力的微孔板定量测定及评价[J].第三军医大学学报,2008,30（6）:
517-520.
[6]王丽,张丽等.儿茶素分光光度法与微量法抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发.2009,21:
664-666.
[7]李红,张元湖.应用DPPH法测定苹果提取物的抗氧化能力[J].山东农业大学学报（自然科学版）,2005,36
（1）:
35-38.
[8]张丽,王丽等.槲皮素微孔板抗氧化微量模型探析[J].河南大学学报（医学版）,2009,28:
26-29.
[9]彭长连，陈少薇等.用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力[J].生物化学与生物物理进展,2000,27（6）:
658-662.
[10]姜红波,赵卫星等.天然抗氧化剂—茶多酚的应用[J].应用化工，2010,,39（10）:
1578-1581.
[11]魏决.天然抗氧化剂茶多酚的提取及抗氧化实验[J].茶叶科学,1994（14）:
93-112.
[12]孙丽萍,王大迁等.11种天然植物提取物对DPPH自由基的清除作用[J].食品科学,2009,30
（1）:
45-47.
[13]陈惠衡,傅冬和等.儿茶素稳定性试验研究[J].食品研究与开发,2009,4（30）:
10-16.
[14]李红,张元湖.应用DPPH法测定苹果提取物的抗氧化能力[J].山东农业大学学报（自然科学版）,2005,36
（1）:
35-38.
[15]SuzukiH,IshigakiA,etal.Long-termeffectofatraceamountofteacatechinswithperillaoilontheplasmalipidsinmice[J].IntJVitamNutrRes,1998,68（4）:
272-274.
[16]OrhanI,kartalM,etal.AntioxidantandanticholinesteraseevalµationofselectedTµrkishSalviaspecies[J].FoodChemistry,2007,103（4）:
1247-1254.
[17]BadamiS,RaiSR,SµreshB.AntioxidantactivityofAporosalindleyanaroot[J].JoµrnalofEthnopharmacology,2005,101
（2）:
180-184.
致谢
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