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荧光原位杂交技术

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荧光原位杂交技术

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硕士学位论文

荧光原位杂交技术及其在环境领域内的应用

Fluorescenceinsituhybridizationtechnologyanditsapplicationinthefieldofenvironment

作者姓名：

**

学科、专业：

环境科学与工程

学号：

********

指导教师：

***

完成日期：

2014/3/26

大连理工大学

DalianUniversityofTechnology

摘要

荧光原位杂交（FISH）是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。

总结了一些实验关键步骤的操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面的应用做了综述。

利用FISH技术在环境样品上直接原位杂交，不仅可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，而且可原位分析它们的空间及数量分布。

并且展望了FISH技术的未来。

关键词：

荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测

Abstract

Fluorescenceinsituhybridization（FISH）isanewtechnologywhichiswidelyusedinmodernmolecularbiologyandgeneticengineering.Thisarticlesummarizestheexperimentalprinciple,processandtechnicalissuesofFISH.Alsowesummarizesomeoperationpointsandmattersneededattentionofkeysteps,andreviewapplicationofFISHinenvironmentalmicrobemonitoring.UsingFISHtechnologydirectlyintheenvironmentalsamples,cannotonlymeasurethemorphologyandabundanceofunculturedmicroorganisms,butalsoanalysetheirspatialdistributionandquantityinsitu.AndlookforwardtothefutureofFISH.

KeyWords：

Fluorescenceinsituhybridizationtechnology;Probe;Environmentalmicrobes;monitoring

TOC\o"1-3"\h\z\uHYPERLINK\l"_Toc384301313"摘要PAGEREF_Toc384301313\hI

HYPERLINK\l"_Toc384301314"AbstractPAGEREF_Toc384301314\hII

HYPERLINK\l"_Toc384301315"1荧光原位杂交技术简介PAGEREF_Toc384301315\h4

HYPERLINK\l"_Toc384301316"1.1FISH发展历史PAGEREF_Toc384301316\h4

HYPERLINK\l"_Toc384301317"1.2FISH原理PAGEREF_Toc384301317\h5

HYPERLINK\l"_Toc384301318"1.3FISH基本过程PAGEREF_Toc384301318\h5

HYPERLINK\l"_Toc384301319"1.3.1探针制备PAGEREF_Toc384301319\h6

HYPERLINK\l"_Toc384301320"1.3.2探针的标记PAGEREF_Toc384301320\h7

HYPERLINK\l"_Toc384301321"1.3.3杂交前处理PAGEREF_Toc384301321\h7

HYPERLINK\l"_Toc384301322"1.3.4杂交PAGEREF_Toc384301322\h8

HYPERLINK\l"_Toc384301323"1.3.5荧光检测与结果分析PAGEREF_Toc384301323\h9

HYPERLINK\l"_Toc384301324"1.4FISH技术特点PAGEREF_Toc384301324\h9

HYPERLINK\l"_Toc384301325"1.5常见的技术问题及解决措施PAGEREF_Toc384301325\h9

HYPERLINK\l"_Toc384301326"1.5.1FISH检测的假阳性PAGEREF_Toc384301326\h9

HYPERLINK\l"_Toc384301327"1.5.2FISH检测的假阴性PAGEREF_Toc384301327\h10

HYPERLINK\l"_Toc384301328"2FISH技术在环境领域的应用PAGEREF_Toc384301328\h10

HYPERLINK\l"_Toc384301329"2.1对硝化细菌的监测PAGEREF_Toc384301329\h10

HYPERLINK\l"_Toc384301330"2.2对除磷细菌的监测PAGEREF_Toc384301330\h11

HYPERLINK\l"_Toc384301331"2.3FISH技术在丝状微生物研究中的应用PAGEREF_Toc384301331\h11

HYPERLINK\l"_Toc384301332"2.4对厌氧颗粒污泥中微生物的监测PAGEREF_Toc384301332\h12

HYPERLINK\l"_Toc384301333"2.5对自然环境中微生物多样性的监测PAGEREF_Toc384301333\h12

HYPERLINK\l"_Toc384301334"3未来展望PAGEREF_Toc384301334\h13

HYPERLINK\l"_Toc384301335"参考文献PAGEREF_Toc384301335\h14

1荧光原位杂交技术简介

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）是在20世纪80年代末在HYPERLINK"\t"_blank"放射性HYPERLINK"\t"_blank"原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过HYPERLINK"\t"_blank"免疫细胞化学过程连接上荧光染料。

FISH技术是将HYPERLINK"\t"_blank"DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的HYPERLINK"\t"_blank"单HYPERLINK"\t"_blank"克隆HYPERLINK"\t"_blank"抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。

具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点。

同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色HYPERLINK"\t"_blank"荧光原位杂交技术和染色质HYPERLINK"\t"_blank"纤维荧光原位杂交技术。

1.1FISH发展历史

1986年人们用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行分析，从而建立了荧光原位杂交技术。

1988年，Giovannoni等[1]首次将原位杂交技术引入细菌学研究中，使用放射性标记rRNA寡核苷酸探针检测微生物。

然而由于放射性物质对人体有害，加上实验周期长，操作比较繁杂，人们开始研究使用非放射性物质取代同位素来标记探针，如使用生物素和地高辛标记探针，由此建立了非放射性原位杂交技术。

1989年，Delong[2]首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。

从此，人们越来越多地使用荧光原位杂交技术来检测环境中的微生物样品。

进入20世纪90年代以后,FISH技术在方法上逐步形成了从单色向多色-FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。

多色荧光原位杂交（M-FISH）的最大特点是可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位在一次FISH实验中完成。

Cremer等[3]用生物素和汞或氨基乙酰荧光素标记探针建立了双色FISH技术。

最近，多种标记的探针和荧光染料可以同时测多个靶序列，最新的多色FISH可同时用7种颜色进行检测。

荧光染料具有不同的激发和散射波可以同时检测一个或更多微生物。

FISH技术由于灵敏度高，具有较好的分辨力，实验周期短，操作安全，特别是可以同时分析一种以上的探针，它将成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具，同时FISH技术本身也得到快速发展。

1.2FISH原理

荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针按照碱基互补的原则，与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，形成可被检测的杂交双链核酸，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其它细胞器中的定位，图1.1显示的是荧光原位杂交原理。

图1.1荧光原位杂交原理图

FISH技术的目标分子通常是16SrRNA，因为它在微生物体内具有较高的拷贝数，分布广泛、功能稳定，而且在系统发育上具有适当的保守性。

根据待测微生物体内16SrRNA中某段特异性序列，设计相应的寡核苷酸探针，就可实现对目标微生物的原位检测，而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列，就可在不同水平（如属、种等）上进行检测。

目前，公共和商业数据库中已发布的16SrRNA序列逐渐增多，因此，基于16SrRNA的FISH技术的应用也越来越广泛，对环境样品中微生物的原位研究也越来越方便和准确。

除16SrRNA外，还可以23SrRNA或mRNA等作为研究的目标分子。

1.3FISH基本过程

荧光原位杂交技术基本过程如图所示，主要包括探针制备、探针标记、杂交、荧光检测与结果分析。

图1.2所示的是荧光原位杂交方法标记细胞的基本流程：

图1.2荧光原位杂交方法标记细胞的基本流程

1.3.1探针制备

进行荧光原位杂交试验首先需要有荧光探针。

它是一段带有荧光色素的核酸序列。

探针有很多种，包括：

DNA探针，RNA探针，寡核苷酸探针等。

每种探针的特点如表所示。

表1.1各种探针优缺点[4]

寡核苷酸探针是一种人工合成的、根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度为15-50个核苷酸。

由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域，但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子的数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。

1.3.2探针的标记

对探针的标记是通过把荧光素标记的核苷酸引入探针序列来实现的，根据引入的过程不同，标记方法可分为缺口平移法、随机引物法、PCR法等；缺口平移法：

基本方法是通过酶的作用在5’-3’核酸链上产生随机缺口，再通过酶将核苷酸添加到缺口的3’端，从而把带有荧光色素的核苷酸引入核酸链。

随机引物法是以变性后的探针DNA链为模板，在随机引物的引导下，利用酶活性把标记核苷酸引入DNA链。

PCR法是把荧光色素标记的核苷酸引入DNA链中。

FISH技术的目标分子通常是16SrRNA，因为它在微生物体内具有较高的拷贝数，分布广泛、功能稳定，而且在系统发育上具有适当的保守性。

根据待测微生物体内16SrRNA中某段特异性序列，设计相应的寡核苷酸探针，就可实现对目标微生物的原位检测，而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列，就可在不同水平（如属、种等）上进行检测。

1.3.3杂交前处理

（1）增强细胞通透性

荧光原位杂交实验的程序中，如何增强细胞通透性，保证核酸探针能与目标核苷酸结合是一个重要的问题。

该步骤根据应用固定剂的种类，杂交样品的种类和核酸探针的长度来决定。

某些固定剂能影响细胞的通透性，因此需要利用一些试剂如稀释后的酸、乙醇等进行处理。

另外，使用表面活性剂对样品处理能够较好地增加细胞的通透性。

（2）降低背景

荧光原位杂交中背景的染色是由多种因素造成的，杂交后的洗涤能够降低背景染色。

预杂交也是降低背景染色的一种有效手段，预杂交液与杂交液的不同是在于前者不含有探针。

将玻片浸入到预杂交液中可达到封闭特异性杂交点的目的，从而降低背景染色。

（3）变性

单链的DNA/RNA探针不需要变性。

双链DNA探针杂交前需要变性为单链，一种方式是样本与探针分别变性，其中双链DNA变性是在70℃-80℃条件下变性10分钟左右，然后立刻转移到冰浴中。

而样本是放置在70℃-80℃的变性液中5-10分钟，用70%，85%，100%的系列乙醇脱水，吹干。

另一种方式是共同变性：

样本经过70%，85%，100%系列乙醇脱水快速吹干后，将探针溶液加至玻片上，盖上盖玻片，封片液封固边缘，放置在70℃-78℃的加热板上10分钟左右，然后立即转入37℃的湿盒中。

1.3.4杂交

杂交前的一切准备工作都是为了能让荧光探针在杂交这一步骤中能够进入到细胞内，与目标核苷酸结合。

杂交能否实现决定了整个实验的成败，因此，杂交是荧光原位杂交中最重要也是最关键的一步。

在已经预处理好的样品上滴加杂交液，加盖盖玻片就可以完成杂交。

在杂交区域，探针与目标核苷酸复性，形成DNA-RNA的合体。

盖玻片的作用是防止在杂交过程中的高温情况致使杂交液和探针的挥发。

同时，整个杂交环境应当保持黑暗、潮湿，可在暗盒内洒一定量的杂交液，同时暗盒也必须耐高温不会影响杂交的顺利进行。

盖玻片必须清洁无杂质，同时也要光滑不会产生气泡，还必须不会影响样品细胞与杂交液的接触。

在实验中还必须注意以下环节。

（1）探针的浓度及长度

探针的浓度必须给于该实验最大的信噪比，探针浓度过高会造成背景染色过高，探针浓度过低会导致荧光信号的不足。

因此，最低的探针浓度应达到与靶核酸最大饱和结合度的程度。

根据国内外多数专家学者的经验，认为保存浓度为5ng/μL为最佳浓度。

另外，杂交过程中加杂交液的量也不能太多，杂交液过多易导致盖玻片滑动脱落，影响杂交的结果。

探针的长度对杂交结果也有很大的关系。

探针短则易进入细胞，杂交效率高，杂交时间短，但是信号不是很强烈。

探针长则信号好，易观察，但是不易进入细胞，杂交时间厂，而且配错对的几率也会增加。

（2）杂交温度和时间

杂交温度是杂交能否成功的一个关键因素。

DNA探针需要变性解链后才能进行杂交。

双链DNA变性一半所需要的温度称为DNA的溶解温度（Tm），大多数的DNA探针需要的Tm是90℃，这种高温对保存细胞完整和保持样品黏附在载玻片上是很困难的。

而使用寡核苷酸探针不需要经过这一步骤，但是杂交也需要在60℃左右才能进行，这么高的温度对样品也是很不利的。

因此在杂交过程中需加入一定量的甲酰胺反应液中每增加1%的甲酰胺，Tm值就可降低0.72℃。

可以调节甲酰胺的含量来适当降低杂交的温度。

杂交的温度随着探针的种类不同而不同，杂交的时间也对杂交有较大的影响。

杂交时间过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性杂交。

大部分的DNA探针杂交时间为2-4小时，但是为了稳妥起见，人们将反应时间定地较长，为16-20小时。

而使用寡核苷酸探针是不需要这么长的时间的。

杂交反应的时间应当与探针的长度和细菌细胞通透性有关，在充分进行细胞通透性的处理之后，核酸长度很短的寡核苷酸探针只需要2-6小时便可完成杂交。

杂交时间因探针的种类不同而不同。

1.3.5荧光检测与结果分析

荧光原位杂交的结果观察需要使用荧光显微镜或者激光扫描共聚焦显微镜。

荧光显微镜的特点为：

（1）数值孔径大于普通显微镜，荧光较弱。

（2）光源由汞灯提供全波段的激发光，通过物镜投射于样品上。

（3）有两个特殊滤光片，分别滤除可见光和紫外线。

观察不同荧光标记的探针需要调节不同的滤光片以选定适合波长的激发光

1.4FISH技术特点

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和HYPERLINK"\t"_blank"非放射性标记。

用HYPERLINK"\t"_blank"同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。

缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。

采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。

FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点：

优点：

1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

缺点：

不能达到100%杂交，特别是在应用较短的HYPERLINK"\t"_blank"cDNA探针时效率明显下降。

1.5常见的技术问题及解决措施

1.5.1FISH检测的假阳性

在FISH检测中，寡核苷酸探针的特异性决定了检测结果的可靠性和精确性，所以通常希望设计得到的寡核苷酸最好与数据库中的寡核苷酸一样的精确。

现存数据库的不断扩大和所报道序列的非精确性，探针序列的检测最好用最常规、最新版本的序列数据库进行校对。

而对于一些培养条件苛刻的和暂时无法培养的微生物，应该用点杂交的方法分析探针的特异性，来确定探针设计的合理性。

此外，一些微生物本身具有荧光性，会对FISH检测产生干扰。

虽然自身荧光性有利于复染，但经常降低信噪比，同时掩盖特异的荧光信号。

所以在处理一些混合菌群时要防止自身背景荧光的处理。

使用狭窄波段的滤镜和放大系统以及适当的预处理，可以降低背景荧光[5]。

Lin等发现用H2O2预处理可以有效的减少假阳性[6]。

Taguchi等在使用FISH之前，用HCl预处理可以减少来自荧光标记寡核苷酸探针非特异性吸收的背景荧光以及减少大量的杂质[7]。

Hahn等发现用地高辛标记探针原位观察Frankiastrains与用荧光标记探针相比，不产生自身荧光问题[8]。

1.5.2FISH检测的假阴性

虽然大多数细菌含有高的rRNA丰度，但rRNA丰度变异不仅仅发生在种属间，亦发生在同一菌不同生长阶段，生长率慢的细菌含有低的rRNA丰度[9];有些微生物细胞壁渗透性差，使探针不能充分进入细胞内与rRNA分子杂交，这些都将导致假阴性结果。

因此，优化渗透性、用高亮度的荧光染料Cy3或Cy5和多重探针标记，应用信号放大系统或多核苷酸探针和CARD-FISH均可以增加杂交信号。

Watt。

等用FISH技术分析生长小麦根系的土著细菌、假单胞菌、丝状菌的量以及分布情况时发现使用Cy5或Cy5。

5荧光染料可以避免在观察时看到自身荧光[10]。

一些研究发现用多核苷酸荧光杂交技术和CARD-FISH均可以发现在水体中丰富的古生菌，而寡核苷酸荧光杂交技术无法发现[11]，表明寡核苷酸荧光探针的杂交信号较弱，通过其方法的改进，可以消除实验结果的假阴性。

2FISH技术在环境领域的应用

2.1对硝化细菌的监测

硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自养菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定等步骤，耗时长（4～8w），而且因为所用的培养基有选择性，使得某些易于培养的菌株如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterwinogradskyi等超过了其他硝化细菌，在培养基中处于竞争优势，因此得到的优势类群与样品中的真实情况有差异。

此外，传统的方法对培养困难的硝化细菌无法进行研究。

FISH技术的引入解决了上述困难。

随着人工设计合成的硝化细菌及氨氧化菌探针的不断推出，FISH技术被广泛地应用于活性污泥系统、硝化流化床反应器和膜生物反应器等污水处理系统中。

JuretschkoSL和SchrammA等[12]曾对硝化流化床、普通活性污泥等工艺的活性污泥中硝化细菌的多样性采用FISH法进行了跟踪分析，发现Nitrosospira、Nitrospira为优势菌种，而并未探测到Ni2trosomonas和Nitrobacter。

KazuakiH等[13]EUB338、NSO190、NIT3和NSR1156等探针研究了同时硝化反硝化好氧膜生物反应器中生物膜上的菌群结构，结果表明氨氧化菌是生物膜中的优势菌群，而亚硝酸盐氧化菌则未被检出。

HanWoongLeeL等[14]用EUB338作为一级探针，ALF1b、BET42a、GAM42a和CF319a作为二级探针对两个不同脱氮反应器活性污泥中的分子生物学特征进行了定量研究，结果表明变形菌纲β亚纲是反应器中的优势菌群，变形菌纲γ亚纲是反应器中的第二大优势菌群。

OlavSliekers等[15]采用FISH技术对CAN-ON工艺调试过程中的优势菌种变化进行研究，结果表明：

在厌氧运试阶段，以亚硝酸菌或硝酸菌的核酸探针检测，没有在污泥中检出亚硝酸细菌和硝酸细菌（检测限1%），以厌氧氨氧化细菌的核酸探针检测，大部分细胞呈阳性反应，污泥中的厌氧氨氧化菌占80%左右；在限氧运行7周后，同等测试结果显示活性污泥中的亚硝酸菌与厌氧氨氧化菌所占的百分