细胞工程综合实训报告.docx

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细胞工程综合实训报告

2010—2011学年第二实践学期细胞工程综合实训报告

专业:

班级:

姓名:

学号:

2011年9月1日

实验日期:

2011.7.4-2011.7.12

实验地点：

农学院生物技术实验室及农学院创新实验室

蓝莓细胞悬浮培养

一、实验目的

（1）掌握蓝莓细胞悬浮系建立的方法和原理

（2）学会对悬浮细胞培养物进行细胞计数及绘制细胞生长曲线

二、实验材料

蓝莓愈伤组织

三、实验试剂

MS液体培养基、三氧化铬、0.1%酚藏红花、0.1%荧光素双醋酸酯（FDA）四、实验仪器

超净工作台、高压灭菌锅、旋转式摇床、水浴锅、倒置显微镜、镊子、酒精灯、100ml三角瓶、移液管、PH计、漏斗、不锈钢网、血细胞计数板

五、实验步骤

1、配制MS液体培养基500ml（平均分装在11个三角瓶中），高压灭菌，常温放置1-2天，观察无菌后备用。

2、超净台内，镊子夹取生长旺盛的蓝莓愈伤组织，夹碎放入含MS的培养瓶中，每瓶1-1.5g.扎紧瓶口。

3、将接种完毕的三角瓶置于旋转式摇床上。

100r/min,25-28℃条件下进行振荡培养。

4、培养6-10天后，进行第一次继代培养。

5、悬浮培养物的过滤：

继代培养几天后，若仍含有较大的细胞团，则用适当孔径不锈钢网过滤，再将滤后的悬浮细胞继续培养。

6、细胞数目计算：

取一定体积的细胞悬液，加入2倍体积的8%三氧化铬，置于70℃水浴处理15分钟。

冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散。

混匀后，取一滴悬液置于细胞计数板上计数。

六、注意事项

1、各步骤均需无菌操作!

培养基、用具、器皿等要高压灭菌后方可使用。

2、如培养液浑浊或呈现乳白色，表明已污染。

3、每次继代培养时，应在倒置显微镜下观察培养物中各类细胞及其残余物的情况，有意识的留下圆细胞，弃去长细胞。

七、实验记录

蓝莓愈伤组织悬浮培养

松江鲈鱼细胞体外培养

一、实验材料

松江鲈，捕于鸭绿江。

透明质酸酶、II型胶原酶、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰蛋白酶、L-15、MEM、DMEM/F-12培养基、胎牛血清、含羧甲基壳多糖（50ug/ml）、N-乙酰葡萄糖盐酸盐（50ug/ml）、碱性成纤维细胞生长因子（bEGF,10ng/mL）、表皮生长因子（EGF,10ng/

mL）。

青霉素（1000IU/mL）、链霉素（1000μg/mL）。

磷酸缓冲液PBS:

6.70gNa2HPO4·2H2O,3.25gKH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100mL。

二、实验方法

1、松江鲈鱼鳍、心脏和鳔组织的原代培养

（1）活松江鲈暂养在含有高双抗（1000IU/mL青霉素,1000μg/mL链霉素）的消毒淡水中24h。

（2）将鱼在75%酒精中浸泡1-2min，无菌取出鳍、心脏和鳔组织，经磷酸缓冲液分别漂洗2次。

（3）将组织置于5%FBS-DMEM/F12培养基中剪成约1mm3碎块。

（4）鳍的组织碎块用0.5%透明质酸酶和0.2%II型胶原酶联合消化1h。

（5）心脏组织碎块用0.125%胰酶消化10min。

（6）鳔的组织碎块不进行任何消化。

（7）3种组织碎块分别离心收集沉淀，用5%FBS-DMEM/F12培养基充分悬浮并均匀接种于25cm2培养瓶中。

（8）置24℃干贴处理6h，加入含20%FBS的培养液至5mL，于24℃进行原代培养。

2、松江鲈鱼鳍、心脏、鳔细胞体外的最适培养基、培养温度和最适PH的确定

向干贴6h的鳍、心脏、鳔组织块中分别加入PH=7.0、含羧甲基壳多糖（50ug/ml）,N-乙酰葡萄糖盐酸盐（50ug/ml），碱性成纤维细胞生

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长因子（bEGF，10ng/mL），表皮生长因子（EGF,10ng/mL），含20%胎牛血清的L-15、MEM、DMEM/F-12培养液至5ml/瓶中，置24℃进行原代培养，分别观察组织块在3种不同培养基中细胞的迁出、贴壁及增殖情况，确定最适培养基。

将培养在最适培养基中的三种组织细胞，加入PH=7.0、含羧甲基壳多糖（50ug/ml）,N-乙酰葡萄糖盐酸盐（50ug/ml），碱性成纤维细胞生长因子（bEGF，10ng/mL），表皮生长因子（EGF,10ng/mL），分别置于20℃、24℃、28℃进行原代培养，观察不同温度下细胞的迁出、贴壁及增殖情况，确定最适培养温度。

将培养在最适培养基和最适温度的三种组织细胞，加入PH=7.0、含羧甲基壳多糖（50ug/ml）,N-乙酰葡萄糖盐酸盐（50ug/ml），碱性成纤维细胞生长因子（bEGF，10ng/mL），表皮生长因子（EGF,10ng/mL），分别置于PH=6.6、PH=7.0、PH=7.4进行原代培养，观察不同PH下细胞的迁出、贴壁及增殖情况，确定最适PH。

3、松江鲈细胞的传代培养

松江鲈细胞长成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化处理1-2min，吹下贴壁细胞，将收集细胞悬液接种至2个培养瓶中进行传代培养。

4、松江鲈细胞的生长特性测定

用胰蛋白酶消化法收集对数期松江鲈鳍细胞，计数后将细胞悬浮于含20%小牛血清的L-15培养液（pH=7.0）中，使其终浓度为2.7×105细胞/mL，按1mL/孔的量接种至2块24孔板中，置5%CO2培养箱中20℃培养。

每隔0.5d收集3个孔中的培养细胞，混匀后进行细胞计数。

以

培养时间（d）为横坐标，细胞浓度（细胞/mL）为纵坐标，绘制生长曲线；根据公式T=t×lg2/lg（Nt/N0）计算细胞的群体倍增时间，其中,N0为接种细胞数,Nt为时间t后的细胞数。

三、实验记录

鱼鳍组织原代培养

鱼心脏组织原代培养

微藻的培养及藻蓝蛋白的提取

一、实训目的和要求

1.学习微藻大规模培养的方法。

2.掌握微藻藻蓝蛋白的提取方法。

二、实训内容

1.微藻的大规模培养

2.藻蓝蛋白的提取。

三、实训方法

（一）微藻的大规模培养

1.藻种的分离技术（样品系列稀释分离法）

首先在第一个试管中加入要分离的藻液样品，其他试管中加入等量培养液，加入培养液的体积根据分离样品的具体情况而定（如10ml），从第一试管中吸取和培养液同体积的藻液样品（10mL）加到第二支试管中，充分振荡摇匀，此时藻液被稀释了2倍，再用一支新的移液管，吸取第二支试管中的稀释藻液（10mL）加入第三支试管中，如前振荡，使均匀稀释，此时藻液被稀释了4倍，以后的试管依次采用同样的方法稀释，直到镜检每滴稀释样品中只有1个细胞，可以用这样的稀释藻液进行培养，最终的稀释液种分装到不同的试管中，用棉塞塞好试管，把试管放在有漫射阳光的地方，每日轻轻摇动几次，发现试管中有藻色后进行镜检，如镜检到单种则表示分离成功，此时已达到了分离、纯化的目的，可进行扩大培养。

2.微藻的丰富培养技术

（1）过滤藻种

以350目筛娟过滤藻种，保留过滤液。

（2）接种

取1000ml三角瓶，按10%比例接种微藻。

分别加入N2（F2、CHU13）培养液15ml。

（3）培养

①培养方式

采取实验室内三角瓶通气培养方式。

温度：

25度；光照：

3000-5000lux；光周期：

12:

12；

②日常管理

a.搅拌和充气；

b.调节光照；

c.提供适宜的温度；

d.注意pH值的变化；f.防止污染

③生长情况的观察与检查

a.颜色；

b.运动和沉淀；

c.附壁；

d.菌膜

四、实验记录

藻种分离

藻种分离培养基本数据

心得体会

时间匆匆而过，细胞工程综合实训在我们的忙碌中渐进尾声，回顾这几天来的综合实训，我真的收获了很多，特别是在动手能力方面更是相较于以前提高了很多，在实验的过程中，我积极的听从老师和组长

的指挥，对于不会的问题，虚心请教同学和老师，实践能力提高的同时，我又从实验中加强了对理论知识的掌握，将理论应用于实践，从实践中熟悉理论，将理论和实践做到了有机的结合，这次的综合实训还增加了同学间的友谊，实验顺利的进行需要同学间的互相协作，而相互间的默契才能有良好的协作，我们组就因为相互间的默契快速的完成了实验，实验结果也很不错，细胞工程作为一门专业课，我的对它的学习兴趣一直很高，感谢能有这次的综合实训，让我又一次学习到了细胞工程的知识，在以后的学习中，我还要继续努力，无论学习的过程有多枯燥，我都会坚持住我的原则，不断学习，充实自己。

辽东学院本科学生教学实习成绩评定表

注：

1.“实习名称”应按人才培养方案中的教学实习环节名称填写；

2.本表由学生所在二级学院存档，作为记载学生教学实习成绩的依据。