细胞工程综合实训报告.docx
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细胞工程综合实训报告
2010—2011学年第二实践学期细胞工程综合实训报告
专业:
班级:
姓名:
学号:
2011年9月1日
实验日期:
2011.7.4-2011.7.12
实验地点:
农学院生物技术实验室及农学院创新实验室
蓝莓细胞悬浮培养
一、实验目的
(1)掌握蓝莓细胞悬浮系建立的方法和原理
(2)学会对悬浮细胞培养物进行细胞计数及绘制细胞生长曲线
二、实验材料
蓝莓愈伤组织
三、实验试剂
MS液体培养基、三氧化铬、0.1%酚藏红花、0.1%荧光素双醋酸酯(FDA)四、实验仪器
超净工作台、高压灭菌锅、旋转式摇床、水浴锅、倒置显微镜、镊子、酒精灯、100ml三角瓶、移液管、PH计、漏斗、不锈钢网、血细胞计数板
五、实验步骤
1、配制MS液体培养基500ml(平均分装在11个三角瓶中),高压灭菌,常温放置1-2天,观察无菌后备用。
2、超净台内,镊子夹取生长旺盛的蓝莓愈伤组织,夹碎放入含MS的培养瓶中,每瓶1-1.5g.扎紧瓶口。
3、将接种完毕的三角瓶置于旋转式摇床上。
100r/min,25-28℃条件下进行振荡培养。
4、培养6-10天后,进行第一次继代培养。
5、悬浮培养物的过滤:
继代培养几天后,若仍含有较大的细胞团,则用适当孔径不锈钢网过滤,再将滤后的悬浮细胞继续培养。
6、细胞数目计算:
取一定体积的细胞悬液,加入2倍体积的8%三氧化铬,置于70℃水浴处理15分钟。
冷却后,用移液管重复吹打细胞悬液,以使细胞充分分散。
混匀后,取一滴悬液置于细胞计数板上计数。
六、注意事项
1、各步骤均需无菌操作!
培养基、用具、器皿等要高压灭菌后方可使用。
2、如培养液浑浊或呈现乳白色,表明已污染。
3、每次继代培养时,应在倒置显微镜下观察培养物中各类细胞及其残余物的情况,有意识的留下圆细胞,弃去长细胞。
七、实验记录
蓝莓愈伤组织悬浮培养
松江鲈鱼细胞体外培养
一、实验材料
松江鲈,捕于鸭绿江。
透明质酸酶、II型胶原酶、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰蛋白酶、L-15、MEM、DMEM/F-12培养基、胎牛血清、含羧甲基壳多糖(50ug/ml)、N-乙酰葡萄糖盐酸盐(50ug/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(bEGF,10ng/mL)、表皮生长因子(EGF,10ng/
mL)。
青霉素(1000IU/mL)、链霉素(1000μg/mL)。
磷酸缓冲液PBS:
6.70gNa2HPO4·2H2O,3.25gKH2PO4,溶于蒸馏水并定容至100mL。
二、实验方法
1、松江鲈鱼鳍、心脏和鳔组织的原代培养
(1)活松江鲈暂养在含有高双抗(1000IU/mL青霉素,1000μg/mL链霉素)的消毒淡水中24h。
(2)将鱼在75%酒精中浸泡1-2min,无菌取出鳍、心脏和鳔组织,经磷酸缓冲液分别漂洗2次。
(3)将组织置于5%FBS-DMEM/F12培养基中剪成约1mm3碎块。
(4)鳍的组织碎块用0.5%透明质酸酶和0.2%II型胶原酶联合消化1h。
(5)心脏组织碎块用0.125%胰酶消化10min。
(6)鳔的组织碎块不进行任何消化。
(7)3种组织碎块分别离心收集沉淀,用5%FBS-DMEM/F12培养基充分悬浮并均匀接种于25cm2培养瓶中。
(8)置24℃干贴处理6h,加入含20%FBS的培养液至5mL,于24℃进行原代培养。
2、松江鲈鱼鳍、心脏、鳔细胞体外的最适培养基、培养温度和最适PH的确定
向干贴6h的鳍、心脏、鳔组织块中分别加入PH=7.0、含羧甲基壳多糖(50ug/ml),N-乙酰葡萄糖盐酸盐(50ug/ml),碱性成纤维细胞生
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长因子(bEGF,10ng/mL),表皮生长因子(EGF,10ng/mL),含20%胎牛血清的L-15、MEM、DMEM/F-12培养液至5ml/瓶中,置24℃进行原代培养,分别观察组织块在3种不同培养基中细胞的迁出、贴壁及增殖情况,确定最适培养基。
将培养在最适培养基中的三种组织细胞,加入PH=7.0、含羧甲基壳多糖(50ug/ml),N-乙酰葡萄糖盐酸盐(50ug/ml),碱性成纤维细胞生长因子(bEGF,10ng/mL),表皮生长因子(EGF,10ng/mL),分别置于20℃、24℃、28℃进行原代培养,观察不同温度下细胞的迁出、贴壁及增殖情况,确定最适培养温度。
将培养在最适培养基和最适温度的三种组织细胞,加入PH=7.0、含羧甲基壳多糖(50ug/ml),N-乙酰葡萄糖盐酸盐(50ug/ml),碱性成纤维细胞生长因子(bEGF,10ng/mL),表皮生长因子(EGF,10ng/mL),分别置于PH=6.6、PH=7.0、PH=7.4进行原代培养,观察不同PH下细胞的迁出、贴壁及增殖情况,确定最适PH。
3、松江鲈细胞的传代培养
松江鲈细胞长成单层后,用0.25%胰蛋白酶消化处理1-2min,吹下贴壁细胞,将收集细胞悬液接种至2个培养瓶中进行传代培养。
4、松江鲈细胞的生长特性测定
用胰蛋白酶消化法收集对数期松江鲈鳍细胞,计数后将细胞悬浮于含20%小牛血清的L-15培养液(pH=7.0)中,使其终浓度为2.7×105细胞/mL,按1mL/孔的量接种至2块24孔板中,置5%CO2培养箱中20℃培养。
每隔0.5d收集3个孔中的培养细胞,混匀后进行细胞计数。
以
培养时间(d)为横坐标,细胞浓度(细胞/mL)为纵坐标,绘制生长曲线;根据公式T=t×lg2/lg(Nt/N0)计算细胞的群体倍增时间,其中,N0为接种细胞数,Nt为时间t后的细胞数。
三、实验记录
鱼鳍组织原代培养
鱼心脏组织原代培养
微藻的培养及藻蓝蛋白的提取
一、实训目的和要求
1.学习微藻大规模培养的方法。
2.掌握微藻藻蓝蛋白的提取方法。
二、实训内容
1.微藻的大规模培养
2.藻蓝蛋白的提取。
三、实训方法
(一)微藻的大规模培养
1.藻种的分离技术(样品系列稀释分离法)
首先在第一个试管中加入要分离的藻液样品,其他试管中加入等量培养液,加入培养液的体积根据分离样品的具体情况而定(如10ml),从第一试管中吸取和培养液同体积的藻液样品(10mL)加到第二支试管中,充分振荡摇匀,此时藻液被稀释了2倍,再用一支新的移液管,吸取第二支试管中的稀释藻液(10mL)加入第三支试管中,如前振荡,使均匀稀释,此时藻液被稀释了4倍,以后的试管依次采用同样的方法稀释,直到镜检每滴稀释样品中只有1个细胞,可以用这样的稀释藻液进行培养,最终的稀释液种分装到不同的试管中,用棉塞塞好试管,把试管放在有漫射阳光的地方,每日轻轻摇动几次,发现试管中有藻色后进行镜检,如镜检到单种则表示分离成功,此时已达到了分离、纯化的目的,可进行扩大培养。
2.微藻的丰富培养技术
(1)过滤藻种
以350目筛娟过滤藻种,保留过滤液。
(2)接种
取1000ml三角瓶,按10%比例接种微藻。
分别加入N2(F2、CHU13)培养液15ml。
(3)培养
①培养方式
采取实验室内三角瓶通气培养方式。
温度:
25度;光照:
3000-5000lux;光周期:
12:
12;
②日常管理
a.搅拌和充气;
b.调节光照;
c.提供适宜的温度;
d.注意pH值的变化;f.防止污染
③生长情况的观察与检查
a.颜色;
b.运动和沉淀;
c.附壁;
d.菌膜
四、实验记录
藻种分离
藻种分离培养基本数据
心得体会
时间匆匆而过,细胞工程综合实训在我们的忙碌中渐进尾声,回顾这几天来的综合实训,我真的收获了很多,特别是在动手能力方面更是相较于以前提高了很多,在实验的过程中,我积极的听从老师和组长
的指挥,对于不会的问题,虚心请教同学和老师,实践能力提高的同时,我又从实验中加强了对理论知识的掌握,将理论应用于实践,从实践中熟悉理论,将理论和实践做到了有机的结合,这次的综合实训还增加了同学间的友谊,实验顺利的进行需要同学间的互相协作,而相互间的默契才能有良好的协作,我们组就因为相互间的默契快速的完成了实验,实验结果也很不错,细胞工程作为一门专业课,我的对它的学习兴趣一直很高,感谢能有这次的综合实训,让我又一次学习到了细胞工程的知识,在以后的学习中,我还要继续努力,无论学习的过程有多枯燥,我都会坚持住我的原则,不断学习,充实自己。
辽东学院本科学生教学实习成绩评定表
注:
1.“实习名称”应按人才培养方案中的教学实习环节名称填写;
2.本表由学生所在二级学院存档,作为记载学生教学实习成绩的依据。