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百合病毒脱除技术研究进展

百合病毒脱除技术研究进展-农学论文

百合病毒脱除技术研究进展

丰先红，李健，罗孝贵

（甘孜藏族自治州农业科学研究所，四川康定626000）

摘要：

百合病毒病是一类影响百合经济价值和观赏价值的重要病害，严重制约了百合商品生产的发展，去除百合病毒病最好的方法是采用脱毒培养技术获得无病毒种苗，进行无病毒种球生产。

详述了百合中常用的病毒脱除技术，包括茎尖培养、珠芽培养、热处理、化学药剂处理和多种方式结合应用等几种，以及近几年新兴的一种脱毒技术——低温疗法，指出百合病毒脱除研究新方向，以期为生产无病毒百合种苗提供参考。

关键词：

百合；病毒；脱毒

中图分类号：

S682.2+9文献标志码：

A论文编号：

cjas15010034

基金项目：

四川省农科院、甘孜州“院州”第二轮农业科技合作项目“甘孜州常用地产中藏药材研究与产业推进”（sngzny12-1504）。

第一作者简介：

丰先红，女，1980年出生，四川广安人，高级农艺师，硕士，主要从事植物生物技术。

通信地址：

626000四川甘孜州康定县炉城南路42号甘孜州农业科学研究所，E-mail：

[emailprotected]。

收稿日期：

2015-01-23，修回日期：

2015-04-22。

0引言

百合是多年生球根花卉，种类和品系均多，花期长，花朵硕大，色彩丰富，花姿优美。

既能作切花、盆花，又能在园林中与乔、灌、草配置，可取得很好的景观效果。

全世界百合属（Lilium）植物共有l15种，其中原产中国的有55个种18个变种，占世界百合属植物的一半。

近年来随着百合生产规模的扩大，种球几代自繁和快速流通使得百合病毒病累积日趋严重，影响了百合的经济价值及花、叶的观赏价值[1]，带病毒的百合花色暗淡、叶片畸形，甚至植株枯死，不带病毒的花色艳丽、植株高大、切花寿命长[2]，而且生长势强、产量高、品质好、商品性优，可在生产中广泛推广应用[3]。

近年来，不少科研工作者利用茎尖培养、珠芽培养、热处理、化学药剂处理及多种方式结合等脱毒技术对百合病毒脱毒效果进行研究，笔者介绍了百合主要病毒病及这些脱毒技术在百合上的研究情况，旨在为今后百合脱毒和无病毒种苗生产提供借鉴。

1侵染百合的主要病毒病

百合的病毒病最早研究来自于Stewart百合的坏死条纹。

到目前为止，报道过的百合病毒共约有19种，植原体（phytoplasma）1种[1,4]。

其中百合潜隐病毒（Lilysymptomlessvirus，LSV）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、郁金香碎花病毒（Tulipbreakingvirus，TBV）、异名百合斑驳病毒（Lilymottlevirus，LMoV）和百合丛簇病毒（Lilyrosettevirus，LRV）等5种病毒病是在百合种球生产中最普遍发生、危害严重的病毒[5-6]，这些病毒主要通过蚜虫等昆虫介体传播，传播速度快，且难以用化学药剂或生物制剂进行直接有效防治。

其他十几种病毒仅在局部栽培地方发生，危害较小。

2百合病毒脱除技术

2.1茎尖培养脱毒

Phillips最早开展百合茎尖脱毒研究，此后茎尖脱毒技术就广泛应用于百合无病毒苗生产。

茎尖组织培养脱毒是最简单、最有效的方法，是植物脱病毒方法中最常用的一种[7]。

此法能与快繁相结合，周期短、效率高。

茎尖组织培养脱毒是否成功主要取决于茎尖的大小，剥取的茎尖太小难以成活，过大则达不到脱毒效果[8-9]。

因此选择适当的茎尖大小，兼顾脱毒率和成活率2个因素，是研究人员一直在探求的问题。

邵增龙等[10]认为茎尖大小在0.2~0.3mm，脱病毒效果较好且易成活。

王超等[11]对5种百合进行茎尖脱毒培养，认为百合剥取0.3~0.8mm茎尖大小最适宜。

张文珠等[12]研究表明，直接剥取0.2~0.5mm的茎尖，脱毒效果比较理想，脱毒率可达到38%，0.5~1.0mm的茎尖效果最差。

陈丽等[13]在对食用百合（卷丹）脱毒工艺研究中成功将茎尖大小控制在0.1~0.2mm，脱毒成功率达到58.9%，成活茎尖的无病毒率达到100%，打破了茎尖大小在0.3mm以下成活率极低甚至于完全不能成活的规律[14-15]。

茎尖二次脱毒是在一次茎尖脱毒成苗后，再次剥取茎尖脱毒，是对茎尖培养脱毒的改进。

张艺萍等[9]对东方百合栽培品种‘Siberia’进行了二次茎尖脱毒效率研究，结果表明二次茎尖脱毒可剥取较大百合茎尖（0.4~0.6mm），且脱毒效果良好。

郑丽娜等[16]认为，经过二次茎尖脱毒的茎尖成苗率和脱毒率高，污染率比较低。

侯娜[17]研究发现东方百合组培苗经过1次茎尖脱毒培养和4次继代脱毒培养后，可以完全脱除CMV和LSV病毒。

可见，二次茎尖脱毒比一次茎尖脱毒更易剥取茎尖，脱除病毒，获取脱毒材料。

2.2珠芽培养脱毒

珠芽培养脱毒是以田间植株上的珠芽或通过鳞片组培获得的珠芽为材料，经过消毒、无菌水冲洗，切取一定大小的珠芽生长点进行培养的方法。

用珠芽作为外植体的优点在于，数量多而个体小，便于采集和剥取，带菌量也比地下的鳞茎少得多，易于灭菌[18-19]。

以珠芽生长点为材料脱毒成功与否也在于生长点切取的大小。

赵祥云等[15]剥取0.3~0.8mm大小的珠芽生长点进行培养，成功地去除了淡黄花百合组培苗的烟草环斑病毒（TRSV）。

张建华等[20]认为以珠芽为材料进行脱毒培养，外植体不能大于1.0mm，0.3~0.8mm的外植体才能达到脱毒要求。

李进等[21]切取宜兴百合珠芽0.2~0.3mm生长点分化培养，成功获得脱毒组培苗，但并未检测病毒脱毒率。

2.3热处理脱毒

热处理去除病毒主要原理是病毒受热后不稳定，活性钝化，繁殖能力下降，失去浸染能力。

影响热处理脱毒效果的主要因素是温度的高低和时间长短，温度越高和处理时间越长脱毒效果越好，但存活率也越低，在实践中通常在较高的温度处理中缩短处理时间，较低温度时适当延长处理时间[4]，处理时间可以几个小时、几天或几个月。

处理温度的高低因病毒抗热性而异，CMV在25℃时就可以脱除，在30℃时LSV比LMoV更易脱除[22]。

张惠华等发现‘Sorbonne’种球经过（39±1）℃恒温处理15天后，LSV整体脱毒效果均好于LMoV，相对容易脱除[23]。

热处理脱毒简单易操作，但需要时间太长，脱毒不完全，脱毒率较低，仅为20%~30%[24]，脱除效果不佳。

目前将热处理与其他方法结合处理在百合脱毒研究中最为常用，相关报道较多。

2.4热处理+茎尖/珠芽培养脱毒

热处理与茎尖/珠芽培养结合脱毒的方法增强了脱毒效果、提高了试验的可操作性，兼顾了脱毒率和成活率2个因素。

二者结合有2种方式，一是先对外植体进行热处理，再剥取茎尖培养，检测病毒脱除效果。

周晓波等[25]对带LSV病毒的卷丹百合珠芽在36℃高温预处理10天，进行芽诱导培养，经过一次继代培养后，用RT-PCR检测LSV病毒，脱毒率达100%，成活率达92%。

陈剑勇[26]以‘索邦’百合的小鳞茎为外植体，用50℃的热水处理30min后，再切取茎尖生长点进行培养，脱毒率可达80%。

徐品三等[27]将感LSV病毒的铁炮百合种球用37℃温度处理20天后，快速繁殖的子球脱毒率达95%以上。

席梦利等[28]将宜兴百合珠芽经过（50±1）℃热水处理40min，培养30天后，切取了较大茎尖（0.8~1.0mm）培养，脱毒率达100%，表明二者结合处理时，可以剥取较大的茎尖培养，能获得较好的脱毒效果。

姜春华[29]研究了东方百合杂交系的2个百合品种种球经过一次高温处理和茎尖培养脱毒后，组培苗再次经过高温处理和茎尖培养的脱毒效果，结果表明，不同品种的百合对递进热处理脱毒的效果反应不一致，‘凝星’百合对高温具有高温钝化现象。

二者结合的另一种方式是先剥取茎尖或珠芽培养，再对试管苗进行热处理，也能较好地脱去病毒。

张文珠[12]以东方百合‘Tiber’为材料，比较了茎尖培养结合热处理和单一茎尖培养的脱毒率，证实结合热处理脱毒率比茎尖培养高。

不同种病毒用不同方法脱除效果差异较大。

高慧卿等[30]以东方百合‘Tiber’无菌苗为材料，研究发现仅用茎尖培养就能将CMV病毒较好的脱除，脱毒率达82.29%，用茎尖培养和热处理结合脱毒才能将LSV病毒较好的脱除，脱毒率达到74.65%。

在二者结合处理中，可以将恒温热处理改变成变温热处理，其脱除病毒效果也比较好，试管苗成活率及脱毒率都要高于恒温处理[31-32]，相关报道也比较多。

杨柏云等[33]探索了变温处理对龙牙百合小鳞茎病毒抑制作用依次为CMV、LSV、TBV、LRV。

李巧峡等[34]对西伯利亚百合试管苗用热空气变温处理42天后茎尖培养，脱毒效果较好。

江洪如等[35]发现龙牙百合鳞茎经过58、38℃变温处理后茎尖培养，4种主要危害百合的病毒粒子可以完全脱除。

郑丽娜[16]比较了5个百合品种变温处理和恒温处理茎尖脱毒效果及茎尖成活率，建议不耐高温的品种采用变温处理为好。

在变温热处理中，改变光暗培养条件对不同种病毒的脱除效果有明显的差异。

罗丽萍等[36]发现龙牙百合小鳞茎经过白天40~42℃、夜晚35℃变温处理60天后脱毒效果最好。

陈进等[37]以麝香百合杂种系品种‘雷山一号’组培苗为材料进行了脱毒试验，表明黑暗、变温热处理结合试管鳞茎培养只对脱除百合植株CMV有效，脱毒率达90%以上；黑暗、变温热处理后，切取≤1mm的茎尖进行光培养能够有效脱除CMV、LSV和LMoV3种病毒，脱毒率达到93.3%。

光培养和暗培养条件对CMV脱除影响的差异不明显，但暗培养对LMoV和LSV的抑制作用略优于光培养。

刘博[38]在高温变温条件（白天38℃、10h，夜间32℃、14h）下对东方百合‘Tiber’带毒（LSV）商品球茎尖（2mm）进行全暗培养1个月成功脱除LSV，而光暗交替培养则无效。

2.5化学药剂处理+热处理+茎尖培养脱毒

化学药剂脱除病毒主要是利用孔雀绿、硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、病毒唑等抗病毒药剂来抑制病毒合成，达到脱除病毒的目的。

这类药剂不能使病毒失活，对寄主有害，应少用。

Kim[39]通过在培养基中添加病毒唑获得了百合无病毒苗。

徐品三等[40]发现‘卡萨布兰卡’的不定芽在添加有10mg/LDHT的液体培养基中培养，LSV脱除效果理想，病毒检出率为零。

单独使用化学药剂脱除病毒的研究报道较少，大多都是与茎尖/珠芽培养和热处理相结合应用。

Xu-PinSan等[41]通过热处理和化学药剂结合的方法获得了70%的‘Georgia’和94%‘Casablanca’珠芽，病毒检测呈阴性。

屈云慧等[42]将百合无菌分株苗植于MS+NAA0.1mg/L+病毒唑5.0mg/L的培养基中培养30天，剥取0.2~0.3mm茎尖培养，脱毒率达到58%。

病毒唑、茎尖培养和热处理三者相结合可获得更好的脱毒效果。

徐榕雪[4]利用茎尖培养与病毒唑相结合方法成功脱除铁炮百合‘雪皇后’的CMV、LMoV、LSV3种病毒。

郑丽娜等[43]用5种脱毒方法研究百合无毒化种球繁育关键技术，结果表明病毒唑加热处理结合茎尖培养方法最好，一次性脱毒率可达到80%以上。

杨柏云等[33]认为病毒唑可促使病毒钝化，结合高温和茎尖培养，可获得无病毒苗。

王超[11]也证实茎尖培养（0.5~0.8mm）加热处理（变温热处理）结合病毒唑（10mg/L）的相结合可使百合成活率及脱毒率达到较高水平。

马平霞[7]对西伯利亚百合脱毒研究表明，2~3cm的试管苗经38℃/16h光照和25℃/8h黑暗培养，热空气处理42天后，切取茎尖0.3~0.5mm，接于分化培养基+5mg/L病毒唑的培养基上培养，脱毒率达到70%，脱毒效果是所用预处理方式中最好的，但此研究结果不能排除光暗培养对病毒脱除效果的影响。

2.6低温疗法脱毒

低温疗法脱毒技术是以超低温保存和植物组织培养为基础的一种新兴的脱毒方法，具有操作简单、快速、脱毒率高等优点[44-45]。

Brison等[46]最先利用超低温保存结合茎尖离体培养方法，成功脱除李豆病毒（PPV），获得了50%的健康植株。

Helliot等[47]利用低温疗法成功地脱除了香蕉中的2种病毒。

Wang等[48]发现超低温处理结合热处理可以脱除茎尖剥离结合热处理无法去除的木莓丛矮病毒（RBDV）。

此法在国外研究较多，国内报道较少。

戴军等[49]将太子参茎尖超低温处理1h后增殖培养，脱毒率可达90%以上。

蔡斌华等[50]利用此法成功脱除草莓轻型黄斑病毒（SMYEV）。

曹庆等[51]剥取较大感染柑桔裂皮病的柑桔茎尖（2~2.5mm）进行玻璃化超低温保存处理，脱毒率也能达到88.2%。

百合利用此法脱毒研究的更少，但有低温冷处理种球结合茎尖培养的报道。

钟海丰等[52]比较了5种脱毒方法，认为4℃冷藏处理百合种球茎尖培养的脱毒方法，脱毒效果最好，出芽率达到62.7%，脱毒率达到88.7%。

张惠华[23]对东方百合品种‘Sorbonne’在2~4℃的冷库休眠84天、15℃室内催芽7天后，再综合热处理、茎尖培养和病毒抑制剂等手段脱毒，发现此法脱除病毒效果最好。

靳慧洁[53]首次研究了东方百合茎尖超低温处理脱毒技术，结果表明培养20天左右的百合苗，经液氮24h处理及在40℃水浴化冻后，剥取0.5~0.8mm茎尖的成活率和脱毒率较高，符合大规模生产的需要。

百合除了上述脱毒方法外，还有花药培养、花丝培养、愈伤组织培养等方法脱毒，相关报道较少。

3小结与展望

综上所述，在百合病毒脱除技术研究中，科研工作者为使脱毒率与成活率之间达到最好平衡点，应用了茎尖培养、珠芽培养、热处理、化学药剂等基本的脱毒方法，但是这些方法都有其缺点。

茎尖培养对操作技术人员要求较高；热处理操作简单，脱毒时间长，脱除效果不理想；化学药剂只能抑制病毒合成，对寄主有害。

因此，大多数工作者在这些基本方法上进行了改进和延伸，比如二次茎尖脱毒、恒温变变温脱毒、改变光暗培养条件、多种方法结合脱毒等方法，取得了很好的脱毒效果，一些百合的组培苗生产也已进入了商业化阶段，然而受病毒种类、百合品种、外植体选择、培养基选配、温度高低、光暗培养时间、脱毒方法及操作技术人员的水平等因素影响，脱毒效果差异较大。

如何提高现有脱毒技术的脱毒率、成活率及探索新的简便有效的脱毒方法是目前百合脱毒研究的重点。

低温疗法是近年来新兴的一种脱毒方法，其操作简单、快速、脱毒率高，更适合批量化、产业化生产，为植物脱去病毒带来新的希望，已成功应用于马铃薯、甘薯、葡萄、柑橘、覆盆子、香蕉[54]等植物上。

低温疗法利用超低温对植物细胞杀伤程度不一致的原理脱去病毒：

超低温能够杀死较大液泡含有病毒的顶端细胞，而保存液泡小的顶端分生组织细胞，这样经过超低温处理的植物再生后就有可能是无病毒的。

百合是集经济、观赏于一体的花卉，在生产生活中应用较广。

低温疗法若能成功应用于百合脱毒，是极具广阔市场前景的。

因此，研究影响百合超低温处理技术的因素，建立超低温脱毒体系以及如何将超低温脱毒与愈伤组织培养、热处理、珠芽培养等脱毒方式相结合是未来百合脱毒研究的重点之重。

在研究过程中，应关注超低温处理的机理性研究，注重培养机理和规律的总结，形成系统化的理论体系，并不断在试验中予以检验；着重对百合组培苗各阶段的生长特性、遗传稳定性、组培苗田间表现以及组织培养过程中生理生化的变化和植物内源激素对其形态发生影响等方面研究。

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