生物技术专业外文翻译优化微波萃取人类苯等离子体.docx

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生物技术专业外文翻译优化微波萃取人类苯等离子体

中文译文：

优化微波萃取人类苯等离子体

P.Fernández&C.Vázquez&R.A.Lorenzo&

A.M.Carro&I.Álvarez&P.Cabarcos

摘要

一个简单快速的微波萃取（MAE）方法，已经评估为固相萃取（SPE）的代替品，SPE对六地西泮的确定在欧洲很多国家被广泛规定在人体血浆。

对于MAE的优化，一个实验设计使用萃取时间、温度、溶剂体积作为影响参数。

一个期望函数被定义，为了同时优化MAE方法。

方差分析显示溶剂体积对所有的样本测试的优化有积极的影响，已经成为统筹全局的重要因素。

同时，萃取时间在四地西泮的萃取中的作用更为突出。

选择MAE的一种情况：

温度89°C、时间13min、8mL的氯仿对应4mL的丙醇：

89.8+0.3%到102.1+5.2%的回收率，因为苯二氮卓类运采用高效液相色谱法结合二极管阵列检测技术。

MAE和SPE的比较结果表明MPE方法更为实用，因为它处理样品简单高效。

苯二氮卓类用户就MAE的适用性在27种等离子种成功测试。

在短期内，苯二氮卓类（简称BZD）是非常有用的精神刺激药物，对紊乱症状很有帮助，比如焦虑、癫痫、失眠。

然而，严重的副作用源于长期经常使用治疗药物，自备配方或者使用过度剂量。

酒精和BZD所产生的效应相结合也许就是一种有助于过激行为的添加剂。

性犯罪和暴力行为可能和BZD的消费有联系，也会导致法医学的并发症。

依赖是可能的风险更大的强效，短效BZD就像阿普唑仑。

在开催眠和焦虑性的处方是，谨慎是必须的，因为长期使用就会产生极大的依赖性。

量化在等离子体也许有助于慢性定量优化，验证符合性和识别改变在药代动力学。

由于这些原因，可靠的优化，快速简单的方法，要控制BZD在等离子体要求节约时间和金钱，而且不丧失灵敏度和再现性分析方法。

液相色谱法已经成为常规测定的一个重要工具，由于它的特异性，速度和灵敏度。

尽管高效液相色谱法（简称HPLC）的质谱检测有很高的选择性，但是仪表的费用使得它不适合临床或者毒理学实验室。

总而言之，HPLC-UV检测或者二极管阵列检测（简称DAD）仪表在分析实验室广泛应用。

一个有效的样品预处理程序之前,液相色谱分离是必须的为了提高灵敏度。

液-液萃取和固相萃取（SPE），在线SPE和固相微波萃取已经成功被运用。

不同的分析方法已经高效发展和建立来设别和量化化合物；一些选定的基于BZD应用的相关信息已在表格1中。

类似极限的检测（简称LODs）在每毫米毫微克的水平已经实现与不同的检测系统，用气相色谱法或者HPLC分离。

微波萃取很适合进行常规分析，无需任何清洗步骤，这个方法效率很高。

此外，MAE使得同步萃取比其它传统的制造工艺产生很少的浪费；因此，它被认为是一种清洁技术。

大量报道关于应用这种技术在环保样品分析。

MAE也已经成功被应用在分析各种医药、维生素和药物滥用，目前应用在制药和生物样品。

配置法设计，提供一种可同时调查多变量和多重反应影响的方法，这种方法已经普遍被使用，比在一段时间内的一个因素的方法更实用，因为他们测试和评估任何变量之间的相互反映，需要相当少的实验来完成优化过程。

这项研究的目的在于确定MAE作为替代品建立处理程序附页的适用性，比如SPE，为了同时提取人类等离子体中六种成分——　阿普唑仑，——疗效及毒素水平显示见表2.一种可行和可靠的HPLC-DAD方法的发展基于微波萃取在苯等离子体，这些等离子体的浓度低于治疗水平，这已经在带刺的样品中得到验证。

这种方法被BZD用户用于分析真正的血浆样品。

化学品

BZD研究标准已经从Cerilliant那里获得。

乙腈，氯仿，异丙胺和甲醇从Merck那里购买。

纯化水从Milli-Q水系统获得。

个别原料的解决方案是每毫升的药物含一毫克的甲醇。

强有力的解决方案含有6BZD，它通过稀释原料来获得最终的浓度，允许等离子体的变化范围是0.06到2ug/mL。

BondElutCertify黑盒是从瓦里安那里获得。

仪表

微波萃取器械采用MPR300/12风气加上S，并配有溶剂检测器。

此器械可以同时提取12种样本，相同条件下在封闭容器萃取，用同步磁力搅拌样本和溶剂。

车载压力控制系统的安装是为了监测和控制血管内提取的压力和条件。

这个烤箱所允许的最大功率是1000W，这个功率变化直到达到所选择的温度。

分析表明，一个水相色谱连接到二极管阵列检测器模型，也来自水域。

用千年软件程序进行数据加工。

样本被注入到不锈钢柱，不锈钢柱来自水域。

确保分辨率最优峰值，因此在合理的短时间内高效分离样本，用流动相洗脱，包括乙腈混合物（简称溶剂A）和0.02M的磷酸盐缓冲剂pH值为7.5（简称溶剂B），流动0.8mL/min，在梯度模式中是0-12min，35%的溶剂A和65%的溶剂B；14-30min，40%的溶剂A和60%的溶剂B；35min，35%的溶剂A和65%的溶剂B。

二极管阵列检测器允许波长在200nm到400nm之间波动以便获得色谱图，即使我们决定在230nm工作，波长也非常接近6BZD的吸收极大值，也就证明可以获得同时色谱响应。

等离子样本

来自加利西亚输液中心无毒的等离子体可以用与校准标准的制备。

等离子样本是从中BZD毒的病人身上获得的，并存放在4°C的环境下，除非分析延迟，这种情况下样本就会结冰。

所有研究执行都是根据世界医学协会的伦理原则，为了医学研究包括人来受试者。

MAE程序

等离子体在离心机上离心十min，14000r/min，为了消除可能共同萃取的化合物，引起矩阵效应。

MAE条件被优化，为了萃取人类苯等离子体作为结果和讨论中的讨论。

最终的优化过程如下：

硼酸缓冲剂（2mL，pH值为9.0）加到1mL的等离子体中，样本在89°C萃取13min，用8mL的氯仿和2mL的丙醇。

冷却后，打开萃取血管然后离心10min，4000r/min，来从水域中分离有机相。

上清收集起来后在一种氮流中40°C集中干燥。

萃取液在200uL的流动相溶解，产量比原本在等离子体中的五倍还多。

高速离心5min，14000r/min后，20uL的上清被注入到色谱中。

SPE程序用于SPE的方法已经准确地验证了，一个程序的所有描述在别处也报道过。

总之，500uL的硼酸缓冲，pH值为9.0加到500uL的样本中，此样本含有BZD。

用流形和黑盒从等离子体中分离药物，条件是2mL的甲醇和2mLpH值为6.0的磷酸盐缓冲剂。

然后用5min烘干样本，此样本是3mL的氯仿对应2mL丙醇。

萃取液有氮蒸气在40°C蒸发得到，然后重建成200uL的流相，产量比原本在等离子体中的五倍还多。

最终，20uL的上清被注入到色谱中。

验证程序

程序一定程度上在线性和重复性和再现性得到验证。

针对治疗和毒性浓度，校准曲线通过扣球空白的等离子体产生。

校准曲线建立在六种浓度变化从60-2000ng/mL。

精度在一定程度上表征了相对标准偏差（简称RSD），通过在三种不同浓度（0.06,0.4,2ug/mL）下分析五种带刺的人体血浆样本。

样本的回收率被确定通过三种不同浓度（0.06,0.4,2ug/mL）的带刺的水样的分析。

初步试验

为了评估溶剂对萃取人类苯等离子的影响，许多研究已经全面展开，用不同的溶剂和混合物传统萃取生物矩阵的药物：

（1）调查表；

（2）种；（3）乙酸乙酯（4）氯仿/甲醇（体积1:

1）（6）氯仿/异丙胺（体积1:

4,1:

1,4:

1）。

对于MAE，溶剂被作为一种需要良好的介电常数的萃取剂来吸收微波能并把它转化为热能。

等离子体的含水矩阵通常过于加热样本促进它们释放到周围介质中。

此外，高温度达到微波加热就会大幅度减少萃取时间和所需溶剂体积。

在所有情况下，一毫升的空白等离子体相当于一微克的所有BZD研究。

MAE的一般条件是这样：

10mL的溶剂，80°C，6min。

数据1显示溶剂或会溶解的混合物对带刺的目标样本的萃取的影响。

己烷比其它溶剂更糟。

己烷不能够萃取阿普唑仑，溴基安定和氯羟去甲安定，然而氯羟去甲安定当使用种是不被萃取。

氯仿/异丙胺（体积1:

4,1:

1）混合后所提供的萃取产量比从大量的化合物研究氯仿中发现的少。

氯仿/异丙胺（体积4:

1）对所有的BZD提供最好的萃取结果，被选择为萃取剂。

等离子样本和一体积的硼酸缓冲剂（pH值为9.0）混合，保证BZD在非离子化的形式下并且它们很容易转换成有机相。

添加1,2或者4mL的缓冲液到1mL的等离子体估计用了MAE的一般条件，如上所述：

10mL的氯仿/异丙胺（体积4:

1），6min，80°C。

1:

2的比例混合对所有的BZD都能很好的萃取。

MAE程序的优化

温度，萃取时间和萃取溶剂的体积同步优化，通过制服外壳的设计，此设计有12此实验和三个中央点组成。

在实验领域，五种不同温度（60,75,90,105和120oC），七种时间（2,4,5,7,9,10和12min），三种溶剂体积（4,7和10mL）都被测试过。

实验设计的随机性避免了外部环境的影响。

为每一个二次多项式模型BZD考虑：

xi是因素研究的代码（萃取温度，时间和溶剂体积），y是从每个BZD中获得的回应。

b值是估计多项式系数：

b0是拦截术语，bi是代表每个变量主要影响的系数，bij是二次条款中的系数，负责曲率反映，bij（i≠j）系数描述萃取影响。

实验设计一代和所有的统计分析使用统计软体执行。

根据初步研究，氯仿/异丙胺（体积4:

1）和等离子体/硼酸缓冲剂（体积1:

2）是固定的两个因素。

MAE的效率是通过对每个实验中得到的BZD峰面积的评估。

对模型系数的估计是根据最小二乘线性回归计算得到，并且这些模型已经通过方差分析得到验证。

不变的术语和主要影响的系数是相当显著的。

溶剂体积是一个重要的因素，因为它对所有的BZD来说是积极的，有统计学意义的。

萃取时间对那4种BZD也具有统计学意义，对它们中的三个具有积极影响但是对氯羟去甲安定有消极影响。

一些相互作用和二次条件是有统计学意义的，呈现不同的影响。

三维响应表明情节显示在给定条件下两个变量的影响，另外一个变量是常量。

数据2显示，比如，有些反应模型开发的两个BZD。

最好的反应在中高水平的温度以及溴基安定和阿普唑仑（Fig.2a）高水平的时间中得到了。

然而，氯羟去甲安定，安定和四氢西泮显示了不同的行为，比较好的反应在高水平的时间但是是低水平的温度。

对于氯羟去甲安定，较高反应在温度和时间相反的水平中得到了。

另外，对于所有的BZD比较好的反应在高水平的时间和高水平的溶剂体积中得到了。

然而，一个双重行为为阿普唑仑（Fig.2b），氯羟去甲安定和安定进行了观察研究；在这些情况下，高水平的时间和任意水平的溶剂体积都提供了高反应。

为了发现同步优化条件，多标准决策策略用期望函数优化在没有额外的实验验证下被接受。

这些期望函数被建立作为每个BZD反应的部分特征函数。

这些反应结果被转变成一个无量纲的期望（di）规模，这个期望值从d=0时的不良反应变换到d=1时的完全符合预想的反应。

在第二个步骤，一个全球性的期望函数（D），代表共同最佳的全球质量，是通过结合简单的期望函数和几何平均值计算得到。

进一步的详细资料可以从别处发现。

对大限度D可以从8毫升的氯仿/异丙胺（体积4:

1，89摄氏度，13分钟）中获得（Fig.3）。

在这些条件下，对所有的药品的di预测值都为1.0。

MAE-HPLC-DAD方法的性能

这已经提出的分析方法根据食品及药物管理局（简称FDA）和国际研讨会（简称ICH）的指导原则得到验证。

样本可以从它们的保留时间（即，溴基安定7.66min，阿普唑仑10.52min，氯羟去甲安定17.85min，安定20.53min，四氢西泮26.44min）和是否吸收光谱鉴定出。

生物矩阵中的内源性成分并不干扰感兴趣的血液样本（Fig.4，色谱图C），因此这种方法在等离子体样本中对BZD的决定性被成功选择。

所有的混合物在浓度范围内研究都满足线性关系，并且回归系数振荡在0.9997和0.9999之间。

表格3显示了这个方法的分析特征，通过HPLC-DAD计算SPE和MAE等离子体的萃取物。

LOD被评为最低浓度，它给出色谱信噪比为3，且量化的限制（简称LOQ）被评为最低浓度，它给出色谱信噪比为10。

LODs达到的范围为6.2到12.6ng/mL，LOQs获得的变化范围是20.7到42.0ng/mL。

表格4显示了所有BZD的回收率和精度。

日内精度从0.3%到4.3%的遥感数据之间变化，日外精度从0.3%到6.0%的遥感数据之间变化。

平均回收率从89.8±0.3%到102.1±5.2%之间变化。

比较MAE和SPE

为了测试MAE和SPE校准曲线的统计学意义，有源光网络垂直取向（简称ANOVA）被应用到校准斜坡，测试结果显示MAE在校准斜坡上的变化，或者SPE在95%的置信区间的有意义的。

因此，SPE相比MAE有稍高的校准灵敏度，只有溴基安定和四氢西泮对这两种萃取程序显示相似的校准斜坡值。

表格3和表格4显示了应用两种萃取程序的相对有效性。

所有的除四氢西泮以外的BZD在MAE过程中有较低的LODs和LOQs。

在所有情况下精度都低7%，但是MAE在日内精度和日外精度的遥感数据方面稍有提高。

双重ANOVA被用来评估回收实验的三个因素的不同之处：

A，萃取程序；B，6BZD的分析；C，三种浓度（0.06,0.4和2mL）。

回收方法的显著差异在95%的水平下与最少显著差异方法比较。

在对BZD的分析（p=0.5622），浓度测试（p=0.7095）和它们的萃取过程中都没有发现显著差异（P>0.05）。

当增加一两个萃取程序到BZD研究：

AB互动（p=0.5884），回收率也没有差异。

当增加一两个萃取程序在不同浓度下：

AC互动（p=0.5043），回收率也没有显著差异。

最终，在不同浓度下萃取BZD不能在任何回收率之间取得差异：

BC互动（p=0.9968）。

然而，显著差异在SPE和MAE的回收率（F=7.01，p=0.0111）中被发现（p<0.05）。

多变域测试证实了这些结果并且显示SPE的回收形式已经一元化了，这同MAE的回收方法有显著差异，因为MAE得到的回收率均高于应用经典的SPE。

另外，SPE相对与MAE给出更高的数据分布（SPE：

65%到103.7；MAE：

89.8%到105.3%）。

根据ANOVA的结果，多范围测试结果显示回收率平均值获得在三浓度研究形成一个平均值的同类组。

同样地，回收率平均值获得对所有的BZD也形成了一个平均值的同类组。

人类血浆样品的BZD

MAE的优化和SPE过程的建立被应用在十个BZD用户的血浆样品中，随后这些样品被HPLC-DAD混合。

运用成对的t测试来比较两个样本准备程序的均值。

这个测试基于两个测量值的成对差异。

通常的虚无假设是均值之间的差异为0。

t统计的95%置信区间内的均值是2.239，p=0.0610。

因此α=0.05时H0是拒绝的，统计分析显示MAE和SPE对BZD的萃取不提供显著不同的结果。

在此基础上的结果，优化的MAE-HPLC-DAD方法对等离子样品的常规毒物分析很有效，而且此方法已经被应用到接受BZD治疗的病人的17种等离子样品中。

27个病例中的三个都用MAE加工处理过，发现两种不同的BZD（溴基安定和氯羟去甲安定，安定和氯羟去甲安定，四氢西泮和氯羟去甲安定）。

然而，12个病例中发现的BZD显示毒素水平，然而18个病例显示了治疗水平。

氯羟去甲安定在11种病例中得到论证（范围41.6-783.8ng/mL，平均水平224.9ng/mL），溴基安定在9种病例中得到论证（范围61.6-414.1ng/mL，平均水平201ng/mL）；阿普唑仑在7种病例中得到论证（范围48.4-222ng/mL，平均水平118.5ng/mL）；四氢西泮在2种病例中得到论证（范围73.8-457.6ng/mL，平均水平265.7ng/mL）；安定在1种病例中得到论证（平均水平241.2ng/mL）。

数据4显示了色谱图，标准溶液所含6BZD是2ug/mL，一个真正的病例（含有溴基安定和氯羟去甲安定）和一个空白等离子。

结论:

人类等离子样本的MAE是一种强有力的，快速的和高产量的萃取方法。

关于分析的总时间现如今成为最重要的因素之一，MAE比SPE更加快速，因为在一个微波炉里面12中样品可以同时萃取。

一个简单，迅速及具有验证性的MAE-HPLC-DAD方法被优化，为了敏感的和适当的测定人血浆BZD在治疗和有毒的水平。

BZD日常论证方法的适用性在一个毒理学试验室中展示。

此外，可以肯定MAE方法对其它BZD也适用。

外文原文：