基因工程试验纲要生物学试验教学中心.docx
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基因工程试验纲要生物学试验教学中心
基因工程实验项目
实验一培养基制备及大肠杆菌菌种活化
实验二质粒提取及电泳
实验三PCR钓取目的基因及电泳
实验四PCR产物回收及电泳
实验五PCR回收产物与T-载体连接
实验六连接产物转化与蓝白斑筛选
实验七重组子扩增及PCR鉴定
实验八重组子酶切鉴定
实验一培养基制备及菌种活化
【实验目的】：
熟悉无菌操作规范，掌握菌种活化过程。
【实验原理】：
菌种活化是逐级扩大培养过程，是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物需要将保存的菌种进行2-3代的复壮过程，目的是使保存的菌种逐渐适应培养环境。
【实验仪器及材料】：
无菌操净台、高压灭菌锅、微量移液器、37度恒温培养箱、37度恒温摇床、含有大肠杆菌DH5а菌种。
【实验步骤】：
1.实验用品准备阶段：
实验所需容器及材料：
玻璃平板、50及500ml三角瓶、黄色及蓝色枪头、接菌环，抗生素。
2.LB培养基的配制：
1L
（1）液体LB培养基的配制：
胰蛋白胨（Tryptone）10g
酵母提取物（yeastextract）5g
NaCl5g
pH=7
（2）固体LB培养基的配制：
上述物质溶解后加入琼脂粉15g
3.LB培养基及相关实验材料灭菌（121℃高压灭菌20分钟）
4.制备含有卡那霉素50mg/l的固体平板，灭菌后当固体LB培养基温度降至50-60℃时加入卡那霉素。
5.取存于-70oC的菌种在固体LB培养基上划线，37oC温箱培养12-16h。
6.挑取单菌落于5ml加入相应抗性的液体LB培养基中，37oC
（200-250rpm）摇床过夜培养。
实验二质粒提取及电泳
【实验目的】：
学习质粒提取原理及操作步骤，熟悉质粒的琼脂糖凝胶电泳。
【实验原理】：
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀。
所提取的质粒一般有三种构像，即超螺旋，线形和开环。
（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。
【实验仪器及材料】：
超速离心机、微量移液器、制冰机、电泳仪、微波炉、大肠杆菌DH5а培养液。
【实验步骤】：
一、质粒提取
1.收集菌体2ml,13000rpm，离心2min，弃上清液。
2.加入150μlSolⅠ（含Tris,EDTA,葡萄糖）重悬菌体，可用枪头剧烈振荡。
3.加入150μlSolⅡ（0.2MNaOH,，1%SDS（m/v），需要现用现配，将0.4MNaOH溶液和2%SDS溶液等体积混合），小心轻混，缓慢上下颠倒2－3次。
此时溶液呈黏稠状。
4.加入150μlSolⅢ（冰醋酸，醋酸钾）小心轻混，缓慢上下颠倒2－3次。
有白色絮转沉淀。
5.13000rpm，离心3min。
，取上清液。
加入等体积（大约450μl）酚/氯仿/异戊醇（使用时要注意用枪头吸下液面部分）振荡混合。
此时溶液呈乳浊状。
6.13000rpm，离心3min，取上清液。
加入2倍体积无水乙醇（约900μl或1ml），置于-20oC醇沉10min。
7.13000rpm，离心3min，弃乙醇。
加入1ml70%乙醇，13000rpm，离心3min，弃掉溶液，自然干燥15min。
注意保持质粒的湿润。
8.加入30μl灭菌水溶解质粒后，于4oC保存。
三、1%琼脂糖凝胶电泳的制备
1．选好胶板插好梳子。
2．称取0.25g琼脂糖溶于25mlTAE缓冲液中。
3．在微波炉中80火力溶解，溶解后冷却，不烫手时加入1.5ul的EBr倒入胶板中赶走气泡，使其凝固。
三、电泳
1.取3ul质粒加入3ul6Xloadingbuffer,混匀。
2.将梳子拔下，点样后通电进行电泳。
3.紫外凝胶仪器中观看PCR电泳结果。
实验三PCR扩增目的基因及电泳
【试验目的】：
利用PCR方法获得目的基因，学习PCR实验原理及操作步骤，掌握PCR程序设定及产物的琼脂糖凝胶电泳
【实验原理】：
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：
模板DNA经加热至94℃一定时间后成为单链②模板DNA与引物的退火（复性）：
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的子链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”。
【实验仪器及材料】：
PCR仪、电泳仪、微量移液器、微波炉、实验二所提质粒，预混Taq酶。
【实验步骤】：
一、PCR反应
1.取模板（实验二所获得的质粒）2-3ul加入装有预混Taq聚合酶的PCR小管中
2.加入引物1，2各1ul
3.加入灭菌水补齐体系
体系如下：
25ul体系
体系组分
用量（μl）
PremixrTaq酶
12.5
引物1（10μM）
1
引物2（10μM）
1
DNA模板
3
加ddH2O到25μl
4.将样品混合物混匀置于PCR仪中
5.PCR程序设定
（1）94℃预变性3分钟
（2）94℃变性50秒
（3）50℃退火50秒
（4）72℃延伸50秒
第二步到第四步30个循环
（5）72℃8分钟
（6）4℃保存
二、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳
1%琼脂糖凝胶电泳的制备
1．选好胶板插好梳子。
2．称取0.3g琼脂糖溶于30mlTAE缓冲液中。
3．在微波炉中80火力溶解，溶解后冷却，不烫手时加入1.5ul的EBr倒入胶板中赶走气泡，使其凝固。
4.在PCR产物中加入5ulloadingbuffer后混匀。
5.选择DNA2000marker为标准上样。
6.PCR产物上样。
7.在紫外凝胶成像系统中观察实验结果。
实验四：
PCR产物回收及电泳
【实验目的】：
从琼脂糖凝胶中回收目的基因片段，学习利用试剂盒回收目的片段的过程。
【实验原理】：
本实验采用的是DNA凝胶回收试剂盒，其原理是：
在凝胶融化液溶液A中凝胶块被迅速融化并释放出DNA。
加入高离液后DNA片段被选择性吸附到（硅胶膜）上。
经溶液c洗涤去除残留在硅胶膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到硅胶膜上的DNA片断经微量水或Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学实验。
【实验仪器及材料】：
高速离心机，DNA电泳仪、DNA片段凝胶回收试剂盒、含有PCR目的片段琼脂糖凝胶。
【实验步骤】:
一、DNA片段回收
1.切去含DNA片段的琼脂糖（100-300mg），尽量切得小一点，用吸头捣碎按质量比1:
3（切取重量：
溶液A的体积比）加入溶液A。
2.55-65度水浴10min,直至胶完全溶化，期间可振荡助溶2-3次，待溶化后置室温加入50ul溶液B，充分混匀。
3.将溶液置于离心柱中，静置2min,≥8000转离心30秒，若一次加不完，可分两次离心。
（静置2min,是必须的，否则明显影响回收效率）.
4.倒掉液体，加入500ul溶液C于离心柱中8000转离心30秒，弃溶液。
5.重复步骤4。
6.12000转再次离心1min，甩干剩余液体以除去残余酒精.
7.将离心柱置于新的离心管中，温室敞开离心管盖放置5-10min，使乙醇挥发殆尽。
8.加入20-30ul溶液D（50度水浴），静置2分钟。
9.12000转离心2分钟，管底溶液即为所需DNA。
将DNA储存于-20度可长期保存。
二、回收片段的琼脂糖凝胶电泳
1．选好胶板插好梳子。
2．称取0.2g琼脂糖溶于20mlTAE缓冲液中。
3．在微波炉中80火力溶解，溶解后冷却，不烫手时加入1ul的EBr倒入胶板中赶走气泡，使其凝固。
4.取PCR回收产物2ul加入2ulloadingbuffer后混匀。
5.选择DNA2000marker为标准上样。
6.PCR产物上样。
7.在紫外凝胶成像系统中观察实验结果。
实验五PCR回收产物与目的载体连接
【实验目的】：
学习基因片段与载体连接过程。
【实验原理】：
pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体。
本载体由pUC18载体改建而成，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3’末端添加“T”而成。
因大部分耐热性的DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用该载体可以提高PCR产物与目的片段的连接和克隆效率。
【实验仪器及材料】：
pMD18-TVector试剂盒，恒温循环水浴，制冰机。
【实验步骤】：
1．在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5ul。
pMD18-TVector*1
1ul
DNA回收片段
0.1pmol~0.3pmol
dH2O
upto5ul
2.加入5ul（等量）的solutionI
3.16oC反应30分钟
（1）室温（25oC）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低
（2）5分钟也能正常的进行连接反应，但反应效率稍微低。
（3）长片段PCR产物（2kbp以上）进行DNA克隆时，延长反应时间。
实验六连接产物转化与蓝白斑筛选
【实验目的】：
将连接产物转入受体菌进行目的基因扩增，学习大肠杆菌转化过程，掌握蓝白斑筛选的实验原理。
【实验原理】：
当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，为感受态，低温时质粒容易与感受态细胞吸附，经升温热刺激后被感受态细胞吸收，质粒上有编码相应抗性的基因，因此转化的细菌在抗性平板上生长。
蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，载体有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选称为蓝白斑筛选。
【实验仪器及材料】：
37度恒温培养箱、37度恒温振荡摇床、无菌操净台。
【实验步骤】：
1.将10ul连接反应体系加入到200μlDH5a感受态细胞中，轻轻旋转，混匀内容物，冰浴30min。
2.将1.5μlEP管放入预加热的42oC水浴锅中，恰恰放置90s，热休克时不可摇动EP管。
3.迅速将EP管移到冰中，使细胞立即冷却2min。
4.加入200μLB培养液，37oC（160-225）rpm摇床培养1h。
5.将管中液体全部取出涂布于含相应抗性的LB培养基平板上（平板上加入氨苄抗生素50mg/ml,并涂有IPTG40ul（20mg/ml）,X-Gal20ul（20mg/ml）），37oC温箱培养12-16h。
6.次日，观察是否有菌落长出,白色菌落为阳性克隆。
实验七重组子扩增及PCR鉴定
【实验目的】：
对转化得到的重组子进行鉴定，进一步熟悉PCR操作过程。
【实验原理】：
重组子如果成功转入受体菌就会带有目的基因，利用PCR方法可以检测目的基因是否存在从而鉴定重组子是否为阳性克隆。
【实验步骤】：
一、PCR过程
1.在5mlLB培养基中加入终浓度为50mg/l的Amp。
2.挑取白色菌落于LB培养基中37度摇床过夜培养。
3.提取重组子质粒（提取操作见实验二）进行PCR鉴定。
4.取模板2-3ul加入装有预混Taq聚合酶的pcr小管中。
1．加入引物1，2各1ul。
2．加入灭菌水补齐体系。
体系如下：
25ul体系
体系组分
用量（μl）
PremixrTaq酶
12.5
引物1（10μM）
1
引物2（10μM）
1
DNA模板
3
加ddH2O到25μl
7.将样品混合物混匀置于PCR仪中。
二、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳
1．选好胶板插好梳子
2．称取0.3g琼脂糖溶于30mlTAE缓冲液中
3．在微波炉中60火力溶解，溶解后冷却，不烫手时加入1.5ul的EBr倒入胶板中赶走气泡，使其凝固
4.在PCR产物中加入5ulloadingbuffer后混匀
5.选择DNA2000marker为标准上样
6.PCR产物上样
7.在紫外凝胶成像系统中观察实验结果。
实验八重组子酶切鉴定
【实验目的】：
学习酶切原理，实验操作及意义
【实验原理】：
DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
在分子克隆中得到了广泛应用限制性内切酶识别长度为4至6个核苷酸的回文序列，有的产生平末端的DNA段（如SmaⅠ:
5'-CCC↓GGG-3'）;产生带有单链突出末端的DNA段称粘性未端,如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
【实验仪器及材料】:
37度恒温培养箱、酶制剂、电泳仪。
【实验步骤】：
1.参看T载体酶切位点和片段上的酶切位点，选择XbaI和HindIII进行双酶切。
2.反应体系如下
体系组分
用量（μl）
DNA质粒模板
3
HindIII
1
XbaI
1
共用MBuffer
2.5
加ddH2O到25μl
3.酶切体系置于37度2-4小时。
4.酶切产物电泳
（1）选好胶板插好梳子
（2）称取0.3g琼脂糖溶于30mlTAE缓冲液中
（3）在微波炉中60火力溶解，溶解后冷却，不烫手时加入1.5ul的EBr倒入胶板中赶走气泡，使其凝固
（4）在酶切产物中加入5ulloadingbuffer后混匀
（5）选择2000marker为标准上样
6．酶切产物上样
7.在紫外凝胶成像系统中观察实验结果。
备选实验：
一、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
【实验目的】：
掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源DNA转入受体菌细胞的技术，熟悉无菌操作流程。
【实验原理】：
受体细胞经过一些特殊的方法如氯化钙等化学试剂的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
【实验设备及材料】：
冷冻离心机、无菌操净台、高压灭菌锅、微量移液器、0.1MCaCl2、1.5ml离心管。
【实验步骤】：
1.实验用品准备阶段：
实验所需容器及材料：
玻璃平板、50及500ml三角瓶、黄色及蓝色枪头、接菌环，抗生素。
2.LB培养基的配制：
1L
（1）液体LB培养基的配制：
胰蛋白胨（Tryptone）10g
酵母提取物（yeastextract）5g
NaCl5g
pH=7
（2）固体LB培养基的配制：
上述物质溶解后加入琼脂粉15g
3.LB培养基及相关实验材料灭菌（121℃高压灭菌20分钟）
4.菌种活化及感受态细胞制备
（1）取存于-70oC的菌种划线活化，37oC温箱培养12-16h。
（2）挑单菌落于5mlLB培养基中，37oC（200-250rpm）摇床过夜培养。
（3）取200μl过夜培养的菌液加入到20mlLB培养基中，37oC（200-225rpm）摇床培养3-4h。
用分光光度计测量OD600值在0.3-0.4之间。
（4）将培养的菌液分装到冰预冷的1.5mlEP管中，冰浴10min，4oC，4000rpm（约1600g），离心10min。
（5）弃上清液，用1ml冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬，冰浴30min，4oC，4000rpm（约1600g），离心10min。
（6）弃上清液，用100μl冰预冷的0.1MCaCl2溶液和100μl甘油重悬菌体，得到的感受态细胞可立即冻存于-70oC备用。
感受态细胞在12-24h之内转化效果最好。
二、细菌基因组DNA的提取及电泳
【实验目的】：
通过本实验学习细菌基因组DNA提取技术。
【实验原理】：
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
【实验设备及材料】：
高速离心机、恒温水浴锅，37度温箱、移液器、1.5ml离心管、植物促生菌ACC-9。
【实验步骤】:
一、细菌培养及基因组提取
1.培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml的培养物离心12000×1min。
2.沉淀物加入567ul的无菌水（或TE）缓冲液，用吸管反复吹打使之重新悬浮。
加入30ul10%的SDS和15ul20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37摄氏度温育1h，加入3ul的溶菌酶50mg/ml效果更好。
3.加入100ul5mol/LNACl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀，于60度温育10min。
（上下颠倒混匀）
4.离心，取上清液，加入等体积（约800ul）的酚氯仿异戊醇，混匀，离心12000×5nmin，将上清液转入一只新管中。
（抽提两次）
5.加入0.6体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，静止10分钟离心（或用一个封口的巴斯德管）将沉淀转至1ml的70%乙醇中洗涤。
6.离心5min，弃上清液，重新悬浮于100ul的无菌水（或TE）缓冲液。
二、基因组的琼脂糖凝胶电泳
1.选好胶板插好梳子。
2.称取0.24g琼脂糖溶于30mlTAE缓冲液中。
3.在微波炉中80火力溶解，溶解后冷却，不烫手时加入1.5ul的EBr倒入胶板中赶走气泡，使其凝固。
4.取2ul基因组加入2ulloadingbuffer后混匀。
5.选择DNA2000marker为标准上样。
6.基因组上样
7.在紫外凝胶成像系统中观察实验结果。
基因工程实验基本试剂配制：
配制1MTris-HCl（Ph7.4,7.6,8.0）
1．称量121.1gTris置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.按下表量加入浓盐酸调节所需要pH。
4.将溶液定容至1L.
配制1.5Mtris-HCl（pH8.8）
1.称量181.7gTris置于1L烧杯中
2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.用浓盐酸调节pH值至8.8.
4.将溶液定容至1L.
配制酚/氯仿/异戊醇
将Tris平衡酚与等体积的氯仿/异戊醇（24:
1）混合均匀，移入棕色玻璃瓶中4度保存。
配制SolutionI
配制体积1L
1MTris-HCl（pH8.0）25ml
0.5MEDTA（pH8.0）20ml
20%Glucose45ml
水910ml
配制SolutionII
0.4MNaOH
2%SDS（m/v）
现用现配等体积混合
配制SolutionIII
配制体积500ml
KOAC147g
CH3COOH57.5ml
加入300ml去离子水后搅拌溶解
用去离子水定容至500ml
配制Ampicillin100mg/ml
称量5g氨苄加入50ml去离子水中，用0.22um过滤除菌。
IPTG24mg/ml
称量1.2gIPTG加入50ml去离子水，用0.22um过滤膜过滤。
配制X-Gal20mg/ml
称取1gX-Gal加入50ml去离子水，用0.22um过滤膜过滤。
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