米曲霉的制备.docx
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米曲霉的制备
毕业论文
课题名称米曲霉的制备
姓名学号
所在系制药与生物工程系专业年级P09生物制药
指导教师职称讲师
指导教师职称
二O一二年六月八日
摘要
微生物在酱油生产制曲工艺和发酵过程中起着至关重要的作用，在高盐稀态发酵工艺过程中，培养良好的米曲霉菌种不仅可以提高酱油中总氮、氨基酸态氮含量和酱油风味,而且还可以提高原料利用率。
因此米曲霉种曲培养是生产优质酱油的有效保证。
本论文主要介绍米曲霉在不同阶段的扩大培养方法，包括试管菌种、锥形瓶菌种、种曲罐菌种、种曲等方面的培养方法及注意事项。
米曲霉培养温度为28～32℃,培养时间为72h,米曲霉生长最旺盛作用,此时,曲料的曲酶孢子数大于8×109个/g,蛋白酶活力可达1000mg/100g以上。
关键词米曲霉；温度；时间；试管菌种；三角瓶菌种；扩大培养
引言
米曲霉是一类产复合酶的菌株，半知菌亚门，丝孢纲，属真菌中的一种常见种。
菌落生长较快，质地疏松，初成白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。
米曲霉具有丰富的蛋白酶系，能产生酸性、中性和碱性蛋白酶，广泛应用于食品、酿酒等发酵工业中，培养良好的米曲霉菌种不仅可以使酱油产生浓郁的酱香及酯香，提高酱油的的风味而且还可以提高其原料利用率。
因此培养优良的米曲霉种曲是生产优质酱油的重要保障。
1菌种的种类
1.1米曲霉
米曲霉沪3.042菌株是目前国内酱油生产厂家普遍使用的优良菌，其来源是福建省永春县酱园中筛选出来米曲霉，中国科学院编号为3.863菌株，后经上海酿造科学研究所进一步诱变筛选获得沪酿3.042，中科院保藏好3.951。
该菌株分生孢子大，数量多，生长繁殖速度快，对杂菌抵抗力强，易制曲，制曲时间为48h，其蛋白酶活力比原处发的菌株提高30%以上。
1.2黑曲霉
黑曲霉AS3.350与米曲霉沪酿3.042混合制曲，对提高蛋白质原料的利用率以及产品风味均有一定的效果。
2菌种的选择条件
2.1不产生黄曲霉毒素及其他真菌毒素
目前国内外生产中应用的米曲霉、酱油米曲霉、溜曲霉等菌株，虽然属于黄曲霉菌群，但均未发现黄曲霉素，因而是安全的。
2.2酶系全、酶活力高
尤其是蛋白酶活力要求高。
酱油的成分绝大部分来自制曲过程中微生物分泌的多种酶类对原料的分解，除蛋白酶、淀粉酶等酶系以外，还有谷氨酰胺酶、脂肪酶和植物组织分解酶（包括果胶酶、纤维素酶、、半纤维素酶）等，当前国内普遍推广的米曲霉沪酿3.042,酶系比较全，酶活力较高，适于酿造酱油，但其酸性蛋白酶及纤维素酶活力不高。
因此，将其和酸性蛋白酶活力高的黑曲霉混合制曲发酵，能够明显的提高原料的利用率。
2.3对环境适应能力强，生长繁殖快
这样的菌株生长适应期短，孢子萌发快，能迅速居于生长优势地位，抑制杂菌的生长。
沪酿3.042米曲霉十几年来在酿造工业一直保持着生命力，最主要原因就在于它对环境适应性强，制曲管理容易。
2.4酿制的酱油风味好
优良的菌株不仅要求无毒性、酶系全，酶活力高、生长快、制曲容易，而且酿造出来的酱油风味必须良好，否则就不适用。
３试管实验
3.1灭菌
凡用于菌种培养的皿具要彻底清洗和灭菌，试管灭菌前需要配上棉塞并用防潮纸包扎管口。
3.2培养基的制备
试管菌种用土豆培养基（配制方法：
将300g去皮马铃薯切块加1000ml蒸馏水煮沸10～20min再用纱布过滤，滤液补加蒸馏水至1000ml再加20g葡萄糖和20g琼脂，加热溶化分装后，在121℃的条件下灭菌20分钟）。
3.3培养基的鉴别
把新配制并经灭菌的斜面菌种于25～30℃条件下培养3～4天，然后检查确保无污染方可使用。
3.4接种培养
把在无菌条件下移接的米曲霉斜面菌种于25～30℃条件下培养72h待菌种发育成熟后方可使用。
3.5菌种的留选
为使菌种保持良好特性应定期做好分纯工作宜半年进行一次留选产生性能好的菌株。
4锥形瓶培养
4.1原料配比
锥形瓶种培养基每瓶采用麸皮20g面粉4g经混合后，拌入20ml清水，充分拌匀装入预先洗涤，干燥配制好棉塞及经1kg/c㎡蒸汽压、灭菌30min的300ml锥形瓶中装瓶量及料厚1cm为准。
4.2接种培养
菌种培养过程，摇两次瓶，首次在曲料开始发白结块时（约20小时）进行，相隔4-6h当曲料再行结块，则进行第二次摇瓶，经过两天培养后把三角瓶轻轻倒置过来（也可不倒置）继续培养1天，全部长满黄绿色孢子米曲霉发育成熟即可使用，或4℃冰箱待用。
5种曲制备
5.1种曲原料要求
制种曲是为了培养优良的种子，原料必须适应曲霉菌旺盛繁殖的需要。
曲霉菌繁殖时需要大量糖分，而豆粕含淀粉较少，因此在生产加工时，在加入豆粕的同时还要加入一定量的面粉或炒麦。
为了使曲霉菌繁殖旺盛，大量着生孢子，保持曲料松散和空气流通是很必要的，炒麦或麸皮过细会影响通风，应时刻注意曲料的生长情况，随时开风机看曲料是否发白结块，进行翻曲。
5.2做料前检查事项
（1）检查设备是否清洗干净。
（2）水、电、气是否送到
（3）将冷热水灌水注满。
（4）对蒸汽过滤器进行消毒，注意消毒时压缩气阀打开。
（5）检查喷雾头的喷雾状态是否良好（水珠不宜过大）。
（6）调整好电柜，各项温度指标。
5.3做料
将麸皮与面粉按9:
1比例，混合均匀后按1:
1的比例混合（一般117kg麸皮、13kg面粉、130kg水）用面碎机打两遍后装盘，装盘不宜过厚（按130kg来算，每盘重2.7kg左右）。
5.4蒸料
将料车放入罐后，将温度计放好（以能清晰看到30-40℃）之间为宜，关闭罐门，打开密封条、阀门，同时将罐体相连的阀门关好，打开蒸汽阀进蒸汽，首先要预热一次，通气压力开之0.1Mpa后排气目的是将罐内冷气排除，预热完毕后方可蒸料，将温度开之121℃左右、压力0.2Mpa左右，关闭蒸汽阀计时，保温保压30min左右，目的是杀菌（切记保温保压过程中温度要一直在120℃左右，压力在0.2Mpa左右，保温完成后打开排气阀排气之压力为0）。
5.5抽真空
将与外界相连的一个排气阀关闭同时疏水阀关闭，加层的排水阀关闭，然后再打开真空总阀，自来水阀，最后打开真空泵阀，将气压将至-0.04Mpa左右时，按顺序关闭抽真空装置。
5.6降温
首先用热水循环（因开始时热水罐温度很低，与我们所需温度相差甚远），当热水罐温度开至40℃左右时，可以关闭热循环，改为冷水循环，在降温过程中，为加速降温，可以打开风机，将风机频调的稍大即可，当温度降至60℃左右时，开始增压至压力到-0.04Mpa（开始抽真空到-0.04Mpa，但在降温过程中压力压力会将至-0.08Mpa终于）蒸料降温过程中冷干机是一直开着的。
5.7接种
当风温将至35℃时，方可接种，接种前要用75﹪的酒精将接种容器消毒，消毒后将接种容器吹干后方可倒入菌种接种量一般为26个三角瓶，接种时要慢慢晃动接种器避免接种菌容器被菌种阻塞，接种完成后打开增氧阀门，增氧至压力为0Mpa时打开罐后排气阀。
5.8自动培养
接种完成后打开自动培养开喷雾1.5-2小时前期喷雾不需要太多，一般以5min-8min/h为宜，在后期24h左右至50h喷雾10-12min/h为宜，后期50-60h8min-10min/h，60h以后停止喷雾。
表1自动培养过程控制
时间（h）
0-6
6-30
30-38
38-60
60-72
风温（℃）
28-32
28-32
30-34
30-34
28-32
风频（Hz）
15
17
20
20
15
自动培养过程中，风温不要超过33℃，因为风温在33℃时料温已超过34℃。
5.9开罐
开罐后将风机的风频调至20Hz将种曲吹干备用。
5.10操作过程中应注意的问题
（1）麸皮和面粉的配比保证为9：
1。
（2）加水量确保加水量和物料的总质量之比为1：
1。
如果加水不足则会导致在培养过程中因前期缺水而后期无法弥补，从而导致孢子数过低。
（3）粉碎时至少用粉碎机粉碎两遍，直到没有成团的物料为标准。
若粉碎不彻底米曲霉很难充分的利用碳源和氮源，因而影响米曲霉的生长繁殖。
（4）装盘时应尽量保证每盘中的重量基本一样，物料铺的均匀一致，若铺的时间过长后一段时间在物料装盘之前还应先用手搓一下防止物料结块，在培养过程中影响通风。
（5）入罐时一定要记住放温度计，以便在培养过程中控制温度。
（6）蒸煮过程中切记不要开冲镜水，防止观察镜遇凉水而炸裂，在排冷空气时应尽量排尽，以便后期灭菌过程的保温保压。
（7）抽真空前或抽真空后记住一定要把排水阀、疏水阀关闭，使罐体保持一个相通的状态确保后期罐体降温的进行，抽真空时先开真空总阀最后开真空泵、，抽完真空后要及时生压为后面的接种做准备。
（8）降温时可打开风机同时将风频调至45Hz。
这样即可缩短降温时间又能节约资源。
（9）接种前应将和接种有关的器具进行消毒，接种时料温一定要保持在36℃以下风温38℃以下，此温度最适合米曲霉的生长繁殖。
（10）培养接种完后应立即打开与罐体相接的培养阀，这样为了确保罐体的气压与外界大气压相同，以便后期喷雾的进行。
培养过程中喷雾水应定期进行更换，过滤器应定期进行消毒。
喷雾时应该根据料面的干湿度来决定喷雾量的大小以及时间的长短。
（11）开罐以后将除风机以外的所有开关都关死，同时将风频调至20Hz左右将种曲吹干。
为了防止菌种发热应将菌种放在低温干燥的条件下保存。
6种曲的质量标准
6.1感官特性
6.1.1外观
菌丝整齐健壮、孢子旺盛、顶囊肥大，米曲霉呈新鲜黄绿色、无夹心、无异色，发芽率不低于90%,孢子数达100亿个/g（以干基计）。
6.1.2香气
具有种曲固有的曲香味，无霉味、酸味、氨味等不良气味。
6.1.3手感
用手指触及种曲，松软而光滑，孢子飞扬。
6.2孢子数的测定
6.2.1样品的稀释
称取1g种曲放入250ml锥形瓶中然后加入5ml酒精（95%）＋10mlH2SO4（1：
10）＋20ml蒸馏水＋4～5个玻璃珠放在旋涡混合器中振荡2～3min，使分生孢子个个分散，然后用多层纱布过滤、冲洗，使滤渣不含孢子，稀释至500ml容量瓶中。
6.2.2制片
取稀释液1d滴于血球计数板的计数格上，然后将盖片轻轻由一遍向另一遍压下，使盖片与计数板完全密合，液中无气泡，用滤纸吸干多余的溢出悬浮的孢子液，静置数分钟，待孢子沉淀。
6.2.3观察计数
用低倍镜头或高倍镜头观察。
由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微细螺旋，才能不使遗漏。
孢子数位于大格的划线上，应一律取二边计数，而弃另两边，以减少误差。
使16×25计数板时，只计板上四个角上的4个大格（即100个小格）。
如果使用25×16的计数板，除计四个角上的4个大格外，还需要计中央一大格的数目（即80个小格）。
每个样品重复观察计数不少于2次，然后取平均值。
即为该样品种曲的孢子数。
计算：
（1）16×25血球计数板
孢子数（个/g）=N/100×400×10000×V/G
=4×104×NV/G⑴
式中:
N——100小格内包子总数，个；
V——孢子稀释体积，mL；
G——样品重量，g。
（2）25×16血球计数板：
孢子数（个/g）=N/80×400×10000×V/G
=5×104×NV/G⑵
式中：
N——80个小格内孢子数总数，个；
V——样品稀释体积，mL；
G——样品重量，g。
6.2.4注意事项
（1）称样时要尽量防止孢子的飞扬。
（2）测定时，如果发现有许多孢子结集成团或成堆，说明样品稀释未能符合操作要求，因此必须重新称重、振摇、稀释。
（3）生产实践应用时，种曲以干物质计算。
因而需要同时测定种曲水分，计算时样品改为干重量。
样品绝干重量=G（1-W）
式中：
G——样品重，g
W——样品水分的百分比，%
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谢辞
首先感谢我的指导老师王冰，对我的论文提出实践性的建议，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。
王冰老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，虽历时三载，却给以终生受益无穷之道。
对王冰老师的感激之情是无法用言语表达的。
感谢我们的王冰老师，对我的工作和学习加以鼓励，以及就业方面给了我很大帮助，使我对社会对工作有了一种新的认识，对未来充满了信心，在以后的日子里我会跟加努力的工作，再次感谢我们的老师对我的教育和培养。
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