全基因组重亚硫酸盐测序最新版.docx

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全基因组重亚硫酸盐测序最新版

全基因组重亚硫酸盐测序

表观遗传学研究已经证实了特定基因区域的DNA甲基化修饰对于染色体构象、基因表达调控机制有着重要影响，而全基因组DNA甲基化研究将是表观基因组学最为关注的内容之一。

Bisulfite处理能够将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。

特定物种的高精确度甲基化修饰模式的分析，必将在表观基因组学研究中具有里程碑式的意义，并且为细胞分化、组织发育等基础机制研究，以及动植物育种、人类健康与疾病研究奠定基础。

技术优势:

■单碱基精确度:

精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

■里程碑式的研究:

特定物种的表观基因组学研究的重要内容，适用于所有具有精确基因组图谱的物种。

实验流程:

●基因组DNAA超声打断至100-500bp的片段●DNA片段末端修复、3’端加A碱基，连接测序接头。

●采用EZDNAMethylattion-Goldkit进行Bisulfite处理●脱盐处理，PCR扩增后进行文库片段大小选择。

●合格的文库用于上机测序。

信息分析流程图:

生物信息分析:

1.DataClean测序结果进行去污染，去接头处理。

根据测序产生的序列文件*.fq统计read长度，read数量，数据产量。

2.标准信息分析2.1Bisulfite-seeq序列与参考序列的比对在信息分析过程中，首先将每一对reads中正链reads上的C碱基转换为T碱基，而反链reads中的G碱基转换为A碱基。

在此基础上使用SOAP软件，将reads与参考基因组序列进行比对，唯一比对reads将用于甲基化信息的分析。

数据比对统计结果如下:

2.2C碱基测序深度的累积分布甲基化C碱基在基因组上的分布包含三种形式（CG,CHG和CHH，其中H代表A或T或C碱基）。

下述图表中反映了三种不同分布类型的C碱基的测序深度累积分布。

其中横轴表示C碱基测序深度，纵轴表示一定测序深度下C碱基的累积比例（copynum<=1.5即uniquely>

碱基测序深度的累积分布图

2.3不同reads测序深度下的基因组覆盖度横轴表示测序深度，纵轴表示特定测序深度下所对应的基因组覆盖度。

2.4计算C碱基的甲基化水平每一个甲基化C碱基的甲基化水平均按如下公式进行计算:

100*reads/totalreads（例如:

CpG位点的甲基化率=100*支持CG甲基化的reads/支持甲基化的reads+支持非甲基化的reads）全基因组平均甲基化水平反应了基因组甲基化图谱的总体特征。

AveragemethylationlevelforC,CG,CHGandCHH

Pattern

C

CG

CHG

CHH

Mathylationlevel

5.00

80.88

4.89

1.22

2.5全基因组甲基化数据分布趋势甲基化C碱基中CG,CHGG与CHH的分布比例不同分布类型的甲基化C位点在不同物种基因组中出现比例不同，因此，各类型mC（mCG、mCHG和mCHH）的位点数目，及其在全部mC的位点中所占的比例（例:

mCHG所占比例=mCHG数目/mC的总数），在一定程度上反映了特定物种的全基因组甲基化图谱的特征。

不同分布类型甲基化C的数量及比例

Pattern

mCHG

mCHH

Number

1,409,380

4,890

47,583

Proportion

96.41

0.33

3.25

此外，还统计如下数据:

●CG、CHG和CHH中的所有C的甲基化水平●各个染色体中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平●统计不同基因区域内CG、CHG和CHH中C的甲基化水平●不同基因元件区域中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平●CHG、CHH中甲基化C附近的9bp序列的序列特征分析2.6全基因组DNA甲基化图谱染色体水平的甲基化C碱基的密度分布从染色体水平来描述甲基C碱基的的分布情况。

蓝点表示以10kb的窗口统计甲基化C碱基的密度在染色体上的分布情况，光滑曲线则表示不同类型甲基化C碱基（G、CHG和CHH）的密度分布。

染色体上甲基化C密度分布

全基国组不同功能元件区域的甲基化水平分布

2.7差异性甲基化区域（DMR）分析在两个样品基因组相同位置上寻找包含5个CG的窗口，用CG甲基化水平的差异来寻找甲基化有差异的区域。

确定每条染色体上有差异的区域长度和有差异的基因，并对这些基因做GO聚类功能分析，以分析差异相关基因是否有明显的功能聚类，即是否针对性地调控行使某类功能。

DMR分析须基于两个样品进行差异比较。

DMR相关基因的GO聚类分析

3.个性化信息分析根据客户的具体项目需求进行个性化分析。

质控分离至受感染的E.coli,是一段长488,502bp的未甲基化修饰的DNA片段。

在Bisulfite处理中可以作为阴性对照用于计算Bisulfite处理的转化率。

在文库构建过程中，λ-DNA会被加入到样品中（5ngλ-DNA/μg样品DNA），在完成测序后，通过信息分析来计算转化率。

案例分析:

研究者采用全基因组重亚硫酸盐测序方法，对小鼠胚胎干细胞（ES）和神经元祖细胞（NP）进行分析，构建小鼠单碱基对精度全基因组甲基化图谱。

该张图谱显示，小鼠基因组中大部分区域（89.4%）呈现高甲基化状态，小部分区域（6.5%）呈现未甲基化状态，另外还有一部分区域（4.1%）呈现出低甲基化状态（LMRs）。

研究者对这小部分的低甲基化区域很感兴趣，对这些区域的特征进行详细的分析，他们发现转录因子以一种定向的方式促成LMRs模式出现。

如果没有这些转录因子的作用，DNA依然保持甲基化和紧凑包装。

由此研究者提出一种全新的表观遗传模式--转录因子介导的低甲基化调控模式。

小鼠胚胎肝细胞甲基化谱