海南花梨木dna条形码序列测定本科学位论文.docx
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海南花梨木dna条形码序列测定本科学位论文
毕业论文（设计）
题目：
海南花梨木DNA条形码序列测定
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摘要
DNA条形码作为生命体所固有的遗传物质，客观存在于细胞内的物质，不受人为因素干扰，能准确的反映出物种最基本的信息。
为了验证国际生命条形码联盟推荐的MatK，trnH-psbA，ITS2三个候选条形码，在珍贵木材降香黄檀（DalbergiaodoriferaT.Chen）又名花梨木DNA条形码测定中的有效性。
从基地采摘的降香黄檀叶片中提取DNA，用特异性引物进行PCR扩增，得到三条候选条形码的目的片段，扩增成功的DNA片段可用于进一步测序分析。
以PCR扩增成功率和测序成功率初步评价候选DNA条形码片段，评选出最优的条形码片段，为今后利用DNA条形码鉴定木材和构建木材分子条形码数据库提供理论依据。
实验结果：
只有ITS2的条形码片段测序成功，得到对应的序列。
通过NCBI查询黄檀属其他物种的ITS2序列，得到：
降香黄檀的ITS2分子序列与黄檀属植物均不同，其中与越南黄檀差异最小，其次是多裂黄檀。
多重比对后构建该序列的进化树结果说明降香黄檀与越南黄檀、多裂黄檀有着较近的亲缘关系，但又不属于同一植物类群，且三者有着稳定的遗传差异性。
建议把ITS2序列作为鉴定降香黄檀的候选条形码序列。
关键词：
降香黄檀；DNA条形码；ITS2；分子鉴定
Abstract
DNAbarcodeasthegeneticmaterialinlifeinherentthatobjectivelyexistedinthecell,withoutartificialinterference.Itcouldaccuratelyreflectthemostessentialinformationforspecies.
InordertoverifythreecandidatebarcodesoftheMatK,trnH–psbAandITS2recommendedbyCBOLandtheeffectivenessinDalbergiaodorifera’sDNAbarcode.ExtractedDNAofitsleavesfromthebase,usingspecificprimersforPCRamplication.Thepurposeofthethreecandidatesfrombarcodefragmentswereobtainedandthetargetedsegmentwasamplifiedsuccessfullytobeusedforsequencinganalysis.PCRamplificationandsequencingsuccessratecouldbeusedforthepreliminaryevaluationthebarcodefragmentsofcandidateDNA,Selectedthebestbarcodefragment,whichprovidedtheoreticalbasisforusingDNAidentificationofwoodandwoodconstructionmolecule.
Theresultswereasfollows:
onlyITS2codedfragmentwassuccessfullysequenced.andthecorrespondingsequencewasgained.BysearchedITS2ofotherspecieswhichbelongtoDalbergiafromNCBI.Wegottheconsionconclusionthat:
ITS2ofDalbergiaodoriferaweredifferent,withDalbergiatonkinensisminimum,followedbyDalbergiarimosaMultiplecomparisonafterbuildingthesequenceoftheevolutionarytreeresultshowedthatDalbergiaodoriferaDalbergiatonkinensisandDalbergiarimosahadthecloserelationship.Thoughtheyarenotbelongtothesamegroupofplants,andtheyhaveastablegeneticdiversity.SoITS2sequencecanbeuesdtoidentifiedcandidatebarcodeofDalbergia.
Keywords:
DalbergiaodoriferaT.Chen;DNAbarcoding;ITS2;molecularidentification
目录
1前言1
1.1分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展1
1.2研究的目的与意义2
2材料与方法3
2.1材料3
2.2试剂药品3
2.3主要仪器设备3
2.4实验步骤3
2.4.1条形码片段的PCR扩增3
2.4.2条形码片段的纯化与检测5
2.4.3克隆6
2.4.4测序7
3结果与分析7
3.1条形码片段PCR扩增结果7
3.2条形码片段测序结果8
3.3序列分析10
4结论与讨论11
4.1结论11
4.2讨论11
致谢13
参考文献14
1前言
降香黄檀（DalbergiaodoriferaT.Chen.）又名花梨木为黄檀属植物,异花授粉，翅果，主要靠种子繁殖。
以其枝干、根、心材干燥后入药，具行气活血、止血、止痢功效，是国家药典收载名贵南药之一。
现代研究还发现降香黄檀具有抗氧化[1]、抑制中枢[2]等的作用[3]。
降香黄檀心材极耐腐，切面光亮，且香气经久不灭，可用于高档家具、工艺品等。
野生的降香黄檀大多分布于我国海南省中部和南部，且多生于中海拔地区[4]，一般成片生长，形成了以降香黄檀为上层树种的植物群落类型[5]。
品种的种质背景复杂和由各居群所处地理位置不同而产生的水热条件差异，都是降香黄檀具有丰富遗传多样性的影响因素。
降香黄檀生长较为缓慢，从种植到心材出现需要多年的时间，近年来其野生资源已遭毁灭性的破坏，濒于灭绝急需保护[6]。
研究表明，降香黄檀表现较高的遗传多样性，且其适应环境能力强，因此导致其濒危的主要原因可能是其极高的药用价值和工艺价值越来越得到人们重视，导致用量急剧增大，人为乱采滥挖所至[7]。
原有文献记载的有野生分布点区域，现已很难再找到该植物，比如2004年在三亚的南山附近零星有分布降香黄檀小树,到2006年时，该处已无降香黄檀。
现在降香黄檀只有在少数的保护区有少量分布，及部分植物园引种、收集保存和农民种植所保留下来的，数量十分有限[8]。
为保护降香黄檀种质资源和遗传多样性,不只需要宣传保护意识，还要大量地收集现有的降香黄檀种群的种质资源，并加强管理措施，保持其种群中丰富的遗传多样性。
采取就地保护、繁殖，遗传性高且面积较小的群体[9]。
相关的职能部门应加大对偷采滥伐的监管力度，尽量保护每株野生降香黄檀种质资源；全力开展对降香黄檀种质保存及扩大繁殖的研究,扩大居群规模；同时通过高新技术的应用，建立核心种质库的方式提高种质资源管理的质量和效率[10]。
1.1分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展
分子条形码作为生命体所固有的遗传物质，通过DNA水平鉴定技术已成熟地应用于动植物的鉴定[11-12]。
作为客观存在于细胞内的物质，不受人为因素干扰，能更客观且准确的反映出物种的最基本信息[13]。
分子条形码技术的主要应用于筛选出适合的DNA片段，它的黄金时代开始于2003年。
现在已成立的生命条形码联盟CBOL，一个国际自发组织的联盟，在于支持DNA条形码的发展，旨在促进全球的标准化以及相应的DNA条形码研究。
分子条形码技术研究的领域集中于针对具体的科属，针对性地筛选合适的DNA条形码。
它利用一段标准的DNA片段区域作为物种标识，进而快速准确地进行物种鉴定[14]。
理想的DNA条形码应当满足：
有变异性、丰富的系统进化学信息、标准化、片段短、稳定易获取5个标准[15]。
在查看参考文献后从众多研究成果中，选择matK，trnH-psbA，ITS2三条国际生命条形码联盟所推荐的候选片段应用于本次研究[19]。
matK片段长度约为1500bp，位于叶绿体基因内含子内，是叶绿体DNA编码区进化速度最快的片段之一，编码一种参与转录RNA内含子剪切的成熟酶[20]。
其在种内种间变异，种内种间差异较大可以作为所研究的天南星科、柑橘以及近缘植物、姜科砂仁属植物植物DNA条形码分类条形码[21]。
trnH-psbA片段长度为318-322bp，是叶绿体间隔区进化速度最快的片段之一。
该片段在很多研究中表现出很好的物种鉴定效果比如洋金花及其混伪；也可以鉴定山麦冬及其近缘种；在桉属可用于潜在的条形码鉴定研究[22]。
ITS2片段长度为500-750bp,是核糖DNA的内转录间隔区，为主要应用于系统发生学标记的片段之一。
由于该片段进化速度快，被很多的国内外学者所重视，协和医院陈士林科研组在研究了大量的植物样本后提议把ITS2片段作为药用植物DNA条形码[23]。
科学家发现豆蔻属药用植物、葫芦科和景天属药用植物等等都发现ITS2序列可以作为所研究对象的DNA条形码[24]。
如今ITS2序列已成立了独立的数据库，数据正不断地在扩充。
根据其二级结构保守性，科学家可以通过软件预测出ITS2的二级结构，比较其结构的差异同样可以完成鉴定工作[25]。
1.2研究的目的与意义
降香黄檀野生资源已被大量破坏，濒临灭绝，但因其药用和商业价值很高[26]，所以部分不良商贩受利益驱使，用黄檀属其他树种冒充降香黄檀进行销售，因它们密度、材色以及构造与降香黄檀极非常相似[27]，专业技术人员用传统的识别方法很难鉴定，普通消费者更是无法区分和识别，这给消费者造成了巨大的经济损失，也给林业检查和海关人员的识别工作增加了难度[28]。
在本次研究中，为了验证国际生命条形码联盟推荐的MatK，trnH-psbA，ITS2三个候选条形码对降香黄檀分子条形码测定的有效性，用特异性引物对降香黄檀DNA进行PCR扩增，扩增成功的DNA片段用于进一步测序分析，测序成功的条形码片段可用于降香黄檀的研究鉴定。
以PCR扩增成功率和测序成功率初步评价候选DNA条形码片段，为今后利用DNA条形码鉴定木材和构建木材分子条形码数据库提供理论依据。
2材料与方法
2.1材料
基地种植的降香黄檀，采摘树叶提取的DNA作为实验模板。
2.2试剂药品
琼脂糖，TAE，Goldview,TaKaRaExTaq，6×10LoadingBuffer，dNTPMixture，灭菌ddH2O，AL2000MarKer。
2.3主要仪器设备
电子天平；量筒；烧杯；PCR仪；凝胶成像系统；高速冷冻离心机；低温冰箱；移液枪（eppendprf：
2.5µL；10µL；20µL；50µL；100µL）；移液管；微波炉；紫外分光光度计（NanoDropND-1000）；涡旋仪（IKA）；恒温摇床；电泳仪、电泳槽；恒温水浴锅；恒温培养箱；超净工作台；手掌型离心机。
2.4实验步骤
2.4.1条形码片段的PCR扩增
（1）扩增引物
特异性的PCR扩增也同样要求引物的特异性，产物的特异性程度依赖于扩增引物和模板的互补程度。
在本次研究中采用的引物长度为20至23，GC的含量为40%-60%，且没有连续排列的5个碱基[29]。
引物名称和序列见表1。
表1候选条形码片段的扩增引物
Table1.Primersforeachcandidatebarcodingsequencesamplification
扩增片段
Targetsegments
引物名称
Primername
引物序列5’-3’
Primersequence5’-3’
MatK
M1
CGATCTATTCATTCAATATTTC（22）
M2
TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT（22）
trnH-psbA
T1
GTTATGCATGAACGTAATGCTC（22）
T2
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC（23）
ITS2、
I1
ATGCCTCAATCCAGAGAGACCC（22）
I2
TAGCCCCGCCTGACCTGAG（19）
（2）PCR反应体系
采用25μL反应体系，各反应成分：
0.12μLTaKaRaExTaq，2.5μL6×10LodaingBuffer，2μLdNTPMixture，1μL上游引物，1μL下游引物，1μLDNA模板，加入17μL灭菌ddH2O至总体系25μL。
（3）PCR反应条件
表2候选条形码片段的PCR反应条件
Table2.PCRconditionsforcandidatebarcodingsequences
扩增片段
PCR反应条件
MatK
94℃4min，
94℃1min，48℃1min，72℃1min，30cycles
72℃7min
trnH-psbA
94℃1min，
94°C1min,61.1℃45s，72℃1min，30cycles
72℃7min
ITS2
94℃4min
94℃1min，56.4℃1min，72℃1min，30cycles
72℃7min
配置25μL反应体系，用0.5%的琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA，左边第一孔用移液枪注入5μLAL2000做对照。
取1μL6×10LodaingBuffer，5μL样本DNA混合点样于胶孔中。
设置电泳仪U=120V，I=220mA，25分钟后取出凝胶置于凝胶成像系统中紫外灯源下观察PCR产物条带。
2.4.2条形码片段的纯化与检测
（1）条形码片段的纯化
采用天根柱式核酸纯化试剂盒纯化PCR产物（根据电泳检测结果灵活确定待纯化条形码片段的PCR量）。
在紫外灯源下，用锋利的手术刀片将单一的目的条形码PCR产物条带切下，置于灭菌离心管中，并称重。
取500μL平衡液BL活化CA2吸附柱。
按所切下的产物凝胶质量，加入3倍体积溶胶液PN。
50℃水浴10min，期间上下颠倒数次，确保胶块充分溶解。
若依旧有未溶胶块，补加适量溶胶液或延长水浴时间，直至胶块完全溶解。
待冷却至室温的胶块溶解液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，13000*g离心力离心45s，丢弃流出液。
加入600μL漂洗液PW到吸附柱CA2中，13,000*g离心力离心1min。
丢弃流出液，将吸附柱CA2放入收集管中。
重复本操作一次。
将吸附柱CA2放置收集管中，14000*g离心2min，除尽漂洗液。
室温放置吸附柱CA25min，彻底地晾干，避免残留的漂洗液对下一步的实验造成影响。
将吸附柱CA2置于一个干净离心管中，加入35μLddH2O（pH8.0）到吸附膜中间位置，室温放置2min。
13000*g离心2min收集DNA流出液。
将离心所得溶液重新加回吸附柱中，室温放置2min，13000*g再次离心2min，得到纯化后的条形码PCR产物。
（2）电泳检测纯化后的条形码PCR产物
用0.5%的琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的条形码PCR产物。
取5μLAL2000做对照,取5μL纯化产物与1μL6×10LodaingBuffer混合后，点样于凝胶孔中，设置电泳仪U=120V，I=220mA，25分钟后取出凝胶置于凝胶成像系统中紫外灯源下观察PCR产物条带。
2.4.3克隆
（1）纯化产物低温连接
于超净工作台上吸取4µL纯化后的条形码PCR产物、1µLTVector和连接液SolutionⅠ至同一PCR管中，轻弹管壁，使各组混合均匀，用手掌型离心机快速离心，集中溶液，然后置PCR管于PCR仪上，16℃连接20min。
反应结束后将离心管置于冰上。
（2）大肠杆菌转化
在超净工作台上，取50µL感受态细胞并同时加入5µL连接产物（在感受态细胞刚刚解冻时加入链接产物），轻弹混匀后于冰中30min；
结束后，42℃水浴，热激30S，迅速再次冰浴2min；
向混合液离心管中加入250µL灭菌LB培养基（不含氨苄青霉素），混合均匀后，于震荡培养箱37℃200转/min震荡培养1h，可使得大肠杆菌复苏；
取80µL2mg/mlIPTG和40mg/mlX-gal混合，并均匀地涂布在准备好的平板上，在37℃培养箱中放置30min；
待IPTG和X-gal被吸收后，取200µL菌液均匀地涂在平板上，在37℃培养箱中过夜培养（为得到更多的克隆，4000转/min离心1min,弃掉部分上清，保留100-150µL，轻弹悬浮菌液，取全部菌液涂板）。
（3）蓝白菌斑筛选
超净工作台上挑选白色单菌落，置于LB培养基中（含氨苄青霉素），37℃恒温震荡培养5-6h；鉴定阳性克隆需要以培养的菌液为模板，菌液PCR扩增目的条形码片段。
PCR反应体系与反应以鉴定阳性克隆，PCR反应体系及条件与以叶片DNAPCR扩增目的片段体系条件一致。
2.4.4测序
将鉴定转化后的菌液中的11,22,25,30,34,40,43共七个样品寄送深圳华大基因科技有限公司实验室测序，采用ABI3730XL测序仪，采用正反双向测序确保测序结果的可信度，采用DNAStarLasergene6软件处理返回的序列，拼接和去引物。
得到各样本的片段序列信息。
3结果与分析
3.1条形码片段PCR扩增结果
DNA条形码鉴定研究工作的核心在于筛选和鉴定，探索出合适的扩增引物，摸索建立起高效的扩增条件体系，然后评估对候选条形码序列的PCR扩增成功率，以及测序所得高质量的序列的测序成功率。
这是对条形码片段的初步评估。
扩增，测序成功率的高低直接影响了后续条形码序列分析。
通过实验得到三种引物PCR扩增结果如下图，matK片段的扩增成功率低，在凝胶成像图中找不到条带。
trnH-psbA片段和ITS2片段，均有结果。
而经过纯化后的产物凝胶显示ITS2的条带更为清晰。
图1.三种引物的PCR扩增产物电泳分析
Figure1.ElectrophoreticanalysisofthreekindsofprimersforPCRproducts
M:
DNAmarker（AL2000）
1-2:
ITS2;3-4:
trnH-psbA,;5-6:
MatK
图2.PCR扩增产物纯化电泳分析
Figure2.ElectrophoreticanalysisofpurifiedPCRproducts
M:
DNAmarker（AL2000）
1-3:
ITS2;4-6:
ITS2;7-9:
trnH-psbA
3.2条形码片段测序结果
将回收得到的trnH-psbA片段、ITS2片段进行克隆，菌液PCR验证（图3），挑取检测效果较好的条带测序。
测序结果中:
样品DNA的trnH-psbA片段均未得到对应序列，只得到ITS2序列长度为654bp如下：
ACCTGAGGTCGCGTCGTGGGCGATCGACATCGCTCGCGGGTCGCTGGGTACGGAGCTGGTGGAGGCCGCCCTCATGACTGGCCTCGAGAACACGCTCAACCACCGTCTGTCATGGCGCTGCATCCACCACGAACCCGATTTTCAGCCAGCCGCGAGGCGGTGCTCACGGGAGGCCAGCATTCGCCCCGCTCCGTGGCCGGAGGCACAGGGGTTGGGGCGGCGATTGGTGACACCCAGGCAGGCGTGCCCTTGGCCTAGTGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTTGGACTCGAGTGTTGCGACGTCGCCCGTGCGAGCACCGTTTCCGGGCCGACGGGACGCGCTCTGCGATTGTTGATTCCTTGGCGCTTTCCGCGCCGGGGTTTGTTGGTTGTTTCGCCGGGACGAGAGGCCGCGGGGCGCGGCTCCGTCCCGACTTTGAGGGAAGGCGAGCTGCTGGGCAGCTTCGTCTGTCCCGGGTGTTGAAACGTGTCCGCGGGTCTCTCTGGATTGAGGCATAAGGGCAATTCTGCAGATATCCATCACACTGG
图3克隆菌液PCR产物电泳检测
Figure3.ElectrophoreticanalysisofPCRproductsofcloningescherichiacoli
M:
DNAmarker（AL2000）
ITS2:
1-38;trnH-psbA:
39-48
3.3序列分析
根据NCBI中已登录的黄檀属分子的ITS2序列，用DNAMAN做比对。
样品ITS2分子序列黄檀属其他植物均不同，其中与越南黄檀差异最小有8个位点碱基不同，其次是多裂黄檀有15个碱基不同。
表1.降香黄檀、越南黄檀和多裂黄檀的特异性鉴别位点
Table1IdentificationsitesofDalbergiaodoriferaT.Chen,DalbergiatonkinensisandDalbergiarimosaRoxbindifferentoriginsites
N0.
位点
32
70
78
345
406
435
441
530
597
635
636
637
638
639
642
645
样品
C
G
T
A
G
T
C
G
G
G
G
G
C
A
T
G
越南黄檀
C
T
T
A
G
T
C
G
G
C
A
A
T
G
C
T
多裂黄檀
T
G
G
G
T
G
T
C
A
C
A
A
T
G
C
T
通过NCBI中已登录的黄檀属其他13个树种和国槐属植物国槐的ITS2序列，所得序列进行多重比对后采用邻接（NJ）法构建系统进化树（见图4）。
结果显示，外类群槐属植物的国槐
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