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关于鸡胚石蜡组织切片免疫组化中的问题探讨及方法改进
【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的
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关于鸡胚石蜡组织切片免疫组化中的问题探讨及方法改进
作者：
郑敏毛建文王伟章李明李红枝王丽京
【摘要】目的总结鸡胚组织免疫组织化学染色中的操作经验。
方法应用常规免疫
组化方法对不同发育时期的鸡胚石蜡组织切片进行免疫组化染色。
结果免疫组化的方
法检测早期鸡胚发育中的相关抗体的表达定位准确，背景清晰。
结论注意鸡胚免疫组
化的操作要点，有助于提高鸡胚组织的免疫组化染色质量。
【关键词】鸡胚;HE染色;免疫组织化学
1
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鸡胚材料因其价格低廉、经济实用而具有重要的实验价值，广泛应用于肿瘤学、中
药学等研究领域[1]。
而免疫组化方法是常用的病理学技术，为科研和教学提供了直观
的形态学支持[2]。
但由于市面上针对鸡的特异性抗体较少，在做鸡胚的免疫组化时常
用鼠、兔或人等市面上易于得到的抗体，因此常出现一些非特异性着色等问题。
笔者
在对不同时期的鸡胚石蜡组织切片进行常规的HE染色方法和免疫组化染色时，发现
了一些鸡胚组织普遍存在的问题，针对这些问题进行了探讨，并提出了改进的方法。
1材料与方法
1.1材料
本实验室种蛋来源于华南农业大学种鸡场。
鸡胚孵化第3～8天，每天取5～10枚。
将鸡胚内容物移入结晶皿中，小心取出胚胎，用生理盐水冲洗。
整胚浸入4%（）多聚甲
醛固定4～24h。
常规石蜡包埋，5m/片石蜡切片。
1.2方法
1.2.1HE染色切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水，苏木素染色1～2min，自
2
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来水冲洗10min，盐酸乙醇分化30s，自来水冲洗5min，水洗返蓝，伊红液染色30
s～1min。
常规脱水，透明，中性树脂封片。
1.2.2免疫组织化学染色切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育30～45min;约95℃
的枸橼酸缓冲液（pH6.0）中抗原热修复10～20min;正常山羊血清封闭45min后加一抗
（兔抗神经纤维抗体，millipore），工作浓度1∶200，4℃过夜;PBST洗涤3次，每次
10min;滴加HRP标记的二抗（山羊抗兔IgG，北京中杉公司），工作浓度1∶100，37℃
孵育30min;PBST洗涤3次，每次10min;DAB显色5～10min;苏木素轻度复染，中性
树脂封片。
阴性对照不加一抗;阳性对照为小鼠脑石蜡切片。
2结果
对不同时期的鸡胚石蜡切片进行常规HE染色，结果发现鸡胚组织在不同的发育阶
段具有不同的形态结构，即使同一时间段里鸡胚的发育也有一定的差异，这与鸡蛋受
精的时间不同有关。
由图1A可以看出，5日龄鸡胚组织的细胞核被苏木精染成淡蓝
色，而细胞质呈粉红色至红色。
同时还发现在鸡胚眼眶视网膜位置可见褐色的沙粒状
颗粒。
如图1A箭头所示。
对不同时期的鸡胚石蜡切片进行神经丝蛋白（NF）免疫组化染色，结果发现在较大日
龄的鸡胚中才有少量表达且主要表达于鸡胚脊索神经元的胞浆内，呈不同程度淡黄
色，细丝状，如图1B箭头所示（图1C为阳性对照：
小鼠脑皮质神经元）。
神经丝是构
3
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成神经元细胞骨架的主要成分之一[3]，是神经细胞的中间丝,由L、M、H3种蛋白组
成。
神经丝广泛存在于中枢和外周神经组织及其肿瘤中，是神经元的标志[4，5]，其功
能与轴突的管径和神经传导速度有关[6]。
在发育过程中，L和M在动物出生前数天开
始表达，H则是在出生后才出现[7]。
同时在鸡胚眼眶视网膜位置亦可见褐色的沙粒状
颗粒，如图1D箭头所示，结果与HE染色结果相似。
同时由于鸡胚早期发育过程中造
血组织丰富，亦容易出现白细胞、单核细胞着色，见图1E、F。
出现这些现象可能是
由于漂洗片子时未洗干净或者用血清封闭得不够以及DAB显色时间太长等所致。
后经
过不断的摸索，对操作中的关键环节进行改进，如通过充分地漂洗，控制DAB显色时
间，延长血清封闭时间，用3%H2O2处理切片等，发现可以在一定程度上避免这些非
特异性着色。
如图1G、H、I箭头所示。
A.5日龄鸡胚组织HE染色中视网膜色素上皮细胞色素沉着（如图中箭头所示）;B.神经
丝蛋白（NF）在10日龄鸡胚脊索神经元中的表达;C.神经丝蛋白（NF）在小鼠脑皮质神经
元中的表达;D.5日龄鸡胚组织NF免疫组化染色中视网膜色素上皮细胞色素沉着;E、
F.5日龄鸡胚组织NF免疫组化染色中红细胞、粒细胞和单核细胞着色;G.经改进实验方
法后，5日龄鸡胚组织NF免疫组化染色中视网膜色素上皮细胞无明显色素沉着;H、I.
经改进实验方法后，5日龄鸡胚组织NF免疫组化染色中红细胞、粒细胞和单核细胞无
明显着色
3讨论
在进行鸡胚石蜡组织切片的HE染色和神经纤维抗体NeurofilamentM免疫组化实验
4
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中，发现了鸡胚免疫组化过程中容易出现的一些问题,并根据这些问题提出改进的方
法：
tips:
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浅谈灯盏花素对大鼠脑缺血再灌注后脑内Fas表达的抑制作用
【摘要】目的研究灯盏花素对大鼠脑缺血再灌注引起脑损伤的保护作用，探讨其
作用机制。
方法选用40只雄性Wistar大鼠，随机分成5组：
假手术组、生理盐水组
（I?
R组）、MgSO4治疗组、灯盏花素治疗组Ⅰ和Ⅱ（BreⅠ、Ⅱ组）。
结扎中脑动脉，然
后再灌注。
用TUNEL法和免疫组化法分别检测脑组织凋亡细胞和Fas阳性细胞的变
化。
结果①降低脑组织凋亡细胞：
MgSO4组、BreⅠ、Ⅱ组在脑缺血再灌注23h后
海马区凋亡神经元/海马神经元均较I?
R组海马区凋亡神经元/海马神经元低，差异有显
著性。
②降低Fas阳性表达细胞数量：
MgSO4组、BreⅠ组和BreⅡ组在脑缺血再灌注
5
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23h后海马区Fas表达阳性神经元/海马神经元均较I?
R组海马区Fas表达阳性神经元/
海马神经元低，差异有显著性。
结论灯盏花素可显著保护大脑缺血再灌注引起的脑损
伤,可能与其抑制Fas蛋白的表达有关。
其作用优于单用MgSO4。
【关键词】灯盏花素;脑缺血;再灌注;凋亡细胞;Fas蛋白
Abstract:
ObjectiveTostudytheprotectiveeffectandmechanismofbreviscapineonrat
cerebraldamageafterischemia?
reperfusion.Methods40maleWistarratsweredividedinto
fivegroups:
shamgroup,I?
Rgroup,MgSO4treatmentgroup,breviscapinetreatmentgroup
ⅠandⅡ.Thebrainarterywasligatedandtheninfused.Apoptosisofbraincellsand
changesofFaspositivecellswasidentifiedbyTUNELmethodandimmunohistochemical
methodrespectively.Results①Apoptosisofneuronscellsinbrainwasreduced:
Compared
withI?
Rgroup,MgSO4group,BreⅠgroupandBreⅡgroupshowedlowerhippocampus
apoptosisneurons/hippocampalneurons23hrsafterischemia?
reperfusion,andBregroup
waslowerinapoptosisneuronsthanMgSO4group,thedifferencewassignificant.②The
numberofFaspositivecellsincerebralwasreduced:
ComparedwithI?
Rgroup,MgSO4
group,BreⅠgroupandBreⅡgroupwerelowerinhippocampusFas?
positiveneurons/
hippocampalneurons23hrsafterischemia?
reperfusion,andBregroupwaslowerthan
MgSO4groupinapoptosis,thedifferencewassignificant.ConclusionBreviscapinecould
significantlyprotectthebrainfromischemiareperfusionbraininjury,whatmightberelatedto
inhibitionofFasproteinexpression.ItseffectwasbetterthanMgSO4.
6
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Keywords:
breviscapine;cerebralischemia;reperfusion;apoptosiscells;Fasprotein
脑血管缺血性疾病是高致残率和高死亡率的疾病，神经保护药物将有助于减轻缺血
半暗区的损伤，促进脑功能的恢复。
灯盏花素（breviscapine，Bre）是从中药灯盏花中提
取的，其有效成份是4?
羟基黄芩素?
7?
O?
葡萄糖醛酸苷[1]，具有显著的抗血小板和血
栓形成的活性[2,3]。
灯盏花素已被用于治疗缺血性脑血管疾病，通过清除自由基和凋
亡细胞而保护大脑。
在脑缺血前后应用灯盏花素，研究证实其对缺血再灌注
（ischemia?
reperfusion，I?
R）有保护作用[4,5]，然而，其治疗机制尚不完全清楚。
本文进
一步研究灯盏花素（Bre）对大鼠脑缺血再灌注引起脑损伤的保护作用及其可能机制，观
察其保护作用是否比MgSO4更有效。
1材料与方法
1.1材料
40只Wistar雄性大鼠，体质量200～250g，由湖北省实验动物中心提供[许可证编
号：
SCXK（鄂）?
2004?
0509]。
实验室温度保持在（212）℃，相对湿度为50%～
75%;Bre（中国云南省玉溪药业有限公司，纯度95%）溶解于生理盐水，用NaOH调整
pH至6.5;MgSO4（无锡第七制药厂），用母液治疗，传统常用药物;HistostainTM?
SPKits
和抗Fas蛋白抗体为美国SantaCruz生物技术产品。
7
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1.2方法
1.2.1动物分组
40只Wistar大鼠被随机分成5组,每组各8只：
①假手术组：
仅游离双侧颈总动脉但
不予阻断，注射生理盐水20mL/kg;②I?
R组（注射生理盐水20mL/kg）;③BreⅠ组（Bre
50mg/kg）;④BreⅡ组（Bre75mg/kg）;⑤MgSO4组（30mg/kg）。
所有药物在缺血10min
后静脉给药。
实验过程中无死亡和脱失。
1.2.2中脑动脉结扎（MCAO）方法见文献[6]。
1.2.3原位末端标记（TUNEL）染色
用TUNEL方法检测凋亡细胞的DNA片段。
在荧光显微镜下计数凋亡细胞,观察缺血
再灌注2h，5h,23h脑组织凋亡细胞的变化。
1.2.4免疫化学染色
8
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免疫组织化学抗Fas蛋白染色及Fas蛋白阳性细胞表达的观察与半定量测定。
快速取
一部分缺血大脑海马组织，常规经甲醛固定、脱水、包埋、切片（5m），免疫组织化学
染色采用链霉素亲生物素-过氧化物酶法（S?
P法）。
经梯度脱蜡、抗原修复（胰酶消化）、
漂洗、小牛血清封闭非特异抗原、加一抗、漂洗、加二抗、漂洗、3，3?
二氨基联苯胺
染色，苏木素染色、脱水、透明、封片等步骤，在光镜下观察，并进行半定量图像分
析。
20倍物镜下在每张切片梗死灶周边区域即缺血半暗带区取相互不重叠的6个视
野，记取其中Fas蛋白表达阳性细胞，每只大鼠所有切片上阳性细胞密度（以阳性细胞
数/1020视野表示）的（s）作为该只动物缺血半暗带区阳性细胞密度代表值，并显微照
相。
1.2.5统计学处理
采用统计学软件包SPSS11.5进行统计分析。
实验数据用平均数标准差（s）表示，用
Student?
Newman?
Keul检验后再进行方差分析，以P0.05为差异有显著性。
2结果
2.1Bre对神经元凋亡的影响
9
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在缺血再灌注后3个不同的时间点，与I?
R组比较，Bre组和MgSO4组大鼠海马
的平均凋亡细胞明显降低。
Bre组大鼠海马平均凋亡细胞比I?
R组和MgSO4组显著地
减少，差异有显著性。
见表1。
表1脑缺血再灌注2h、5h和23h后Bre对大鼠大
脑海马神经元凋亡的影响（略）
2.2Bre对Fas表达的影响
I?
R组、Bre组和MgSO4组Fas蛋白的阳性表达都增加;Bre组Fas蛋白的阳性表
达比I?
R组、MgSO4组显著减少，其差异有显著性。
见表2。
表2脑缺血再灌注2
h、5h和23h后Bre对大鼠大脑海马神经元Fas表达的影响（略）
3讨论
在脑缺血/再灌注损伤后，神经元凋亡显著增加。
在脑缺血过程中，缺血半暗带区的
多种病理生理过程，包括兴奋性氨基酸毒性、自由基、钙超载、炎症反应及线粒体损
伤都可以触发细胞凋亡。
脑缺血后细胞凋亡的发生是一个主动过程，它依赖于大分子
物质合成，说明细胞凋亡是由基因调控的。
其中与MgSO4组、I?
R组比较：
#P
0.01Fas基因被认为是主要的凋亡促进基因[7]。
本研究探讨了Bre抑制神经元Fas的表
达减少神经元凋亡从而保护大脑的机制。
10
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Fas蛋白又称为APO?
1，现命名为CD95分子[8,9]。
Fas受体（即Fas）与Fas配体
（FasL）分别属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）及肿瘤坏死因子（TNF）家族[10]。
以膜分子或
可溶性分子形式存在于哺乳类动物机体中。
Fas主要以膜受体形式存在，Fas分子由3
部分组成：
膜外的N末段区、跨膜区、膜内的C末段区。
膜外区具有膜受体特征;Fas
的胞质区有一段约80个氨基酸组成的肽链，在细胞凋亡过程中起传递细胞凋亡信号的
作用，故称之为死亡区域。
目前认为作为第二信使的蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）参与脑缺血/再灌注中神经
元凋亡的发生[11]。
PKC抑制剂能显著地缓解缺血性损伤，然而，它具有巨大的毒副
作用和价格昂贵等缺点。
国内学者从传统中药灯盏花中分离得到的野黄芩甙元（又名灯
盏花乙素）,发现它具有抑制PKC的作用,并且属于非竞争性抑制,从而为实验研究提
供了基础[12]。
tips:
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（1）特定部位易发生色素沉着：
在HE染色和免疫组化中，发现在鸡胚头部常见深褐
色的沙粒状颗粒环绕眼眶部位。
极易误解为免疫组化的阳性反应。
实际上是鸡胚视网
膜色素上皮细胞吞噬了染液所致。
鸡胚视网膜色素上皮细胞一般为单层矮柱状细胞。
主要特点是胞质内含有大量粗大、圆形或卵圆形黑色素颗粒，胞质内可见吞噬体。
因
11
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此具有很强的吞噬能力，易于吞噬染料而导致假阳性反应[8]。
见图1A、D。
可能是由
于漂洗片子时未洗干净或者用血清封闭得不够以及DAB显色时间太长所致[9-11]。
因
此在染色前最好充分观察常规切片，了解HE和免疫组化的染色情况，在操作过程中
要注意充分地洗涤、切片。
本实验中将PBS漂洗的时间由常规的5min改为10min;同
时在显微镜下控制显色时间为5～10min，即可获得较为理想的免疫组化染色效果，见
图1G、H、I。
否则背景易上色，见图1E、F。
（2）易出现间质着色：
鸡胚发育中间充
质组织非常丰富，因此免疫组化时易出现间充质组织着色。
间充质着色的原因很多，
如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色，又如
血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色;抗体不
纯或抗体被污染也可出现间质着色。
遇到此种情况可以适当延长血清封闭时间，或选
择单克隆抗体等以避免一些非特异型的结合。
（3）易出现细胞质着色：
胞浆着色局限在
细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。
主要原因
是发育中的鸡胚细胞胞浆里含有较多的蛋白质，还有内源酶，如红细胞中的血红蛋
白、粒细胞、单核细胞中的细胞色素等。
这种原因造成的着色，可以通过延长血清封
闭和3%过氧化氢?
甲醇溶液处理切片的时间来解决。
本研究将石蜡切片用3%H2O2处
理的时间延长至45min，同时将山羊血清封闭的时间延长至45～60min后，发现可以
减轻白细胞、粒细胞、单核细胞的着色，如图1H、I。
（4）不适当的组织处理也可能出
现细胞核着色，如组织在二甲苯或缓冲液里浸泡时间太长、操作过程中组织变干、微
波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下太少，未没过组织等。
解决
办法是应严格按照操作常规进行工作。
还有一个因素是实验成败的关键:
一抗的浓度是
否合适，这关系到能否做出阳性结果。
总之，鸡胚材料虽然应用广泛，但鸡胚组织毕竟不同于一般成熟的组织，要想做出
理想的免疫组化结果并不容易。
因此在鸡胚免疫组化过程中,需根据鸡胚组织的特殊
12
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性，对常规的免疫组化染色方法中相关的步骤进行适当的调整，如延长PBST洗涤的
时间，封闭时间以及3%双氧水?
甲醇溶液处理切片的时间等，才可有效地避免以上问
题的出现，做出漂亮的免疫组化图片。
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