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兽医实验室人员培训内容

培训内容分为三部分：

一、血凝及血凝抑制试验

实验操作为高致病性禽流感抗原及抗体测定

二、间接血凝试验

试验讲解为口蹄疫抗体测定

三、ELISA试验

考试内容分为理论知识及实验技术考核（高致病性禽流感抗原抗体测定）。

血凝试验（hemagglutinationtest）是红细胞凝集试验的简称。

利用特异性抗体或病毒血凝素与红细胞表面相应抗原结合而出现凝集现象，用于检测特异性抗体或病毒血凝素。

红细胞凝集试验血凝和血凝抑制试验  某些病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（hemagglutination，HA），也称直接血凝反应，当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。

这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（hemagglutination inhibiion，HI）反应，也称血凝抑制反应。

血凝抑制（HI）试验禽流感

流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。

HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。

该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。

可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。

HA-HI试验的优点是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法，可用来鉴定所有的流感病毒分离株，可用来检测禽血清中的感染或免疫抗体。

它的缺点是只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素，对于其它禽种，也可以考虑选用在调查研究中的禽种红细胞；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。

1阿氏（Alsevers）液配制

称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。

2鸡红细胞液的制备

2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。

2.2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。

2.310%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800r/min8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积（mL），加入9倍体积（mL）的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。

2.41%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1mL，加入9mL生理盐水，混合均匀即可。

3抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）

3.1在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mLPBS，换滴头。

3.2吸取0.025mL病毒悬液加入第l孔，混匀。

3.3从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。

3.4每孔再加入0.025mLPBS。

3.5每孔均加入0.025mL体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。

3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。

对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。

3.7结果判定将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。

表1：

血凝试验结果判读标准

类别

孔底所见

结果

1

2

3

4

5

红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集

红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈

红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块

红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块

红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集

++++

+++

++

+

-

能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。

注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。

4血凝抑制（HI）试验（微量法）

4.1根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。

以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。

例如，如果血凝的终点滴度为1:

256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:

64（256除以4）。

4.2在微量反应板的1孔～11孔加入0.025mLPBS，第12孔加入0.05mLPBS。

4.3吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。

4.41孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。

4.5每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。

4.6结果判定

以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。

HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。

正向间接血凝试验的原理是将可溶性抗原吸附于与免疫无关的载体（红细胞）表面，此吸附抗原的红细胞与相应的抗体结合，在有电解质存在的适宜条件下发生的肉眼可见的凝集性反应。

正向间接血凝试验是一种用已知抗原检测未知抗体的试验方法，它的操作方法相对简单，实验原理也易于理解，在基层实验条件和技术相对落后的情况下经常被应用到，因此，正确熟练地操作应用，在一些动物疫病的免疫抗体检测、疫病诊断上具有现实意义。

正向间接血凝为一种微量的定量反应试验，因而，任何操作环节的纰漏都会使最后判定的结果与正确结论大相径庭。

充分理解正向间接血凝试验的原理，对整个试验的操作和结果判定都具有很大的指导意义。

操作步骤可简化为:

①稀释液→②待检血清→③对倍稀释→④血凝抗原→⑤震荡静置→⑥结果判定六个环节。

 正向间接血凝试验（IHA）口蹄疫

1原理

用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。

抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。

若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。

这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。

2适用范围

主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。

3试验器材和试剂

3.196孔110°V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板

3.2微量移液器（50μL25μL）取液塑咀

3.3微量振荡器

3.4O型口蹄疫血凝抗原

3.5O型口蹄疫阴性对照血清

3.6O型口蹄疫阳性对照血清

3.7稀释液

3.8待检血清（每头约0.5ml血清即可）56℃水浴灭活30分钟

4试验方法

4.1加稀释液

在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀释液50μL。

4.2稀释待检血清

取1号待检血清50μL加入第1排第1孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧1-2次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔取出50μL移入第2孔，混匀后取出50μL移入第3孔……直至第9孔混匀后取出50μL丢弃。

此时第1排1-9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：

1:

2⑴、1:

4⑵、1:

8⑶、1:

16⑷、1:

32⑸、1:

64⑹、1:

128⑺、1:

256⑻、1:

512⑼。

取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排……均按上法稀释，注意！

每取一份血清时，必须更换塑咀一个。

4.3稀释阴性对照血清

在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50μL，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。

此时阴性血清的稀释倍数依次为1:

2⑴、1:

4⑵、1:

8⑶、1:

16⑷。

第6-7孔为稀释液对照。

4.4稀释阳性对照血清

在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50μL，对倍数稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。

此时阳性血清的稀释倍数依次为1：

2-1：

4096。

4.5加血凝抗原

被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加O型血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μL。

4.6振荡混匀

将血凝板置于微量振荡器上1-2分钟，如无振荡器，用手轻拍混匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。

盖上玻板，室温下或37℃下静置1.5-2小时判定结果，也可延至翌日判定。

4.7判定标准

移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:

16孔，稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集（血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮）。

阳性血清对照1:

2-1:

256各孔应出现“++”—“+++”凝集为合格（少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内）。

在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。

例如1号待检血清1-5孔呈现“++”—“+++”凝集，6-7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:

128。

接种口蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:

128（即第7孔）牛群、羊群免疫抗体效价达到1:

256（第8孔）呈现“++”凝集为免疫合格。

注意事项：

收到试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果。

用不同批次的血凝抗原检测同一份血清时，应事先用阳性血清准确测定各批次血凝抗原的效价，取抗原效价相同或相近的血凝抗原检测待检血清抗体水平的结果是基本一致的，如果血凝抗原效价差别很大用来检测同一血清样品，肯定会出现检测结果不一致。

         ELISA是酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）的简称。

ELISA试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。

将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来，可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来。

ELISA基本原理

（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；

（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；

（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。