重组质粒酶切鉴定及PCR实验.docx
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重组质粒酶切鉴定及PCR实验
重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
一．实验目的
1．检验重组质粒的插入片段的大小
2．学习PCR技术的使用
二．实验原理
（一）重组质粒酶切鉴定
将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
（二）PCR
PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应是1986年由KallisMullis发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
1.聚合酶链式反应原理
PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增。
置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
2．PCR的反应动力学
PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
3．PCR扩增产物
可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。
进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即长产物片段）结合。
引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段。
短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。
这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
三．实验材料及仪器
1．实验材料：
PRC扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝胶成像仪，模板pUC19重组质粒（插入片段125bp和564bp），寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），TaqDNA聚合酶（TaKaRa，-20℃贮存），dNTPs（TaKaRa，-20℃贮存），10×PCR反应缓冲液（TaKaRa，-20℃贮存）
高速离心机，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液（10×），琼脂糖，溴化乙锭（EB），DNA相对分子质量标准物DNAMarkerk／HindⅢ，DL5000
四．实验步骤
（一）重组质粒的酶切、电泳检测
1．对于电泳显示插入片段在2.0kb以上的重组质粒，采用HindⅢ酶切进行验证。
大片段或高产量的重组质粒推荐的反应体系（10μl体系）如下：
成分
体积（μl）
ddH2O
6.2
10×Buffer（含Mg2+）
1.0
Re-Puc19
2.0
HindⅢ（15U/μl）
0.8
共计
10.0
若插入片段比较小，则选用20μl体系：
成分
体积（μl）
ddH2O
9.0-11.0
10×Buffer（含Mg2+）
2.0
Re-Puc19
6.0-8.0
HindⅢ（15U/μl）
1.0
共计
20.0
轻弹混匀后，短暂离心，于37℃孵育2hr后，保存于-20℃，备电泳检测。
2.酶切产物电泳检测
取酶切产物10ul，加入2ul6×上样缓冲液，混匀后取6ul点样。
取重组质粒10ul，加入2ul6×上样缓冲液，混匀后取6ul点样。
以λDNA/HindIII为Marker。
100V恒压电泳约40min。
电泳结束EB染色10min，水洗后紫外灯下观察实验结果。
（二）重组质粒的PCR验证/PCR扩增目的基因
对于电泳显示插入片段在2.0kb以下的重组质粒，采用PCR进行验证。
引物此次重组用到的载体是pUC19，限制性内切酶为HindⅢ，所以选择HindⅢ酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。
由于载体pUC19上两引物间序列的长度是150bp，所以PCR扩增产物的长度（bp）=150+插入片段的长度。
下图所示为pUC19部分序列，即引物来源：
M13F（-47）:
EcoRⅠ
cgccagggttttcccagtcacgacgttgTaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctc
HindⅢM13R（-48）（互补链）
PCR引物为
引物名称
引物序列5’3’
引物长度（mers）
Tm（℃）
M13F（-47）
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
24
64.7
M13R（-48）
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
24
57.9
1.反应体系的建立
PCR反应体系如下：
编号
组分
体积（ul）
1
ddH2O
14.8
2
10×Buffer（含Mg2+）
2.0
3
dNTP（2.5mMeach）
1.6
4
M13F（10μM）
0.8
5
M13R（10μM）
0.8
6
模板（约10ng/μl）
1.0
7
Taq酶（5u/μl）
0.2
总体积
20.0
除了此反应体系之外，还要做三个反应体系：
其他组分不变，只将编号6的组分换成共用564bp模板，pUC19质粒（作为模板对照），ddH2O（作为阴性对照）。
振荡混匀，然后短暂离心。
2.反应程序的设定
将加好样的PCR管进行标记，放入PCR仪中，设定反应基本参数如表所示。
编号
项目
温度/℃
时间
1
预变性
94
3min
2
变性
94
30s
3
复性
58
30s
4
延伸
72
转2，循环29次
5
终延伸
72
10min
6
保存
4
（1）预变性：
让DNA双链充分解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模版上面这主要是为了保险起见，使模板DNA的二级结构充分打开。
（2）变性：
通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。
（3）复性：
当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。
（4）延伸：
在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及镁离子存在的条件下，5＇-→3＇的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
（5）终延伸：
循环完成后使PCR反应完全以提高扩增产量，在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行
3.PCR产物检测：
1%的琼脂糖凝胶电泳：
20ulPCR产物中加3.0ul10×上样缓冲液，混合均匀，取5ul点样。
以DL2000plus为Marker。
100V恒压电泳约40min。
电泳结束EB染色10min，水洗后紫外灯下观察实验结果。
五．实验结果及分析
（一）重组质粒的酶切电泳结果
将重组质粒酶切之后进行凝胶电泳，紫外成像如图1.
图1第1-5组重组质粒酶切凝胶电泳成像图
从左到右各泳道分别为：
第1泳道：
λDNA/HindIII；
第2-19泳道：
第1-5组重组与酶切质粒（R1，R1/HindIII，R2，R2/HindIII）；
第20泳道：
pUC19/HindIII；
第21泳道：
λDNA/HindIII。
我所在的组别是第1组，样品在第2-5泳道。
第2、3泳道分别为重组质粒1和重组质粒1的酶切，具体分析见图2。
第4、5泳道分别为重组质粒2和重组质粒2的酶切，具体分析见图3。
如图2所示。
泳道1为λDNA/HindIII，泳道20为pUC19/HindIII，泳道2为本组重组质粒样品1，泳道3为重组质粒的酶切。
带
（1）大小在5000-6000bp左右，与第2泳道中的重组质粒位置近似，因此带
（1）可以理解为未被酶切开的重组质粒；带
（2）大小4000左右，与第2泳道中重组质粒前面的那条带近似，但却变得暗了，可以判断为未被酶切的重组质粒，也说明泳道2中最前面的那条带为外源DNA重组质粒。
带（3）大小与酶切pUC19质粒大小相似，可以判断为重组质粒酶切后的质粒载体；而带（4）大小在564bp左右，为酶切开的λDNA片段。
图2重组质粒1酶切对比
如图3所示。
泳道1为λDNA/HindIII，泳道20为pUC19/HindIII，泳道4为本组重组质粒样品2，泳道5为重组质粒的酶切。
带
（2）大小4000左右，与第4泳道中的重组质粒位置近似，因此带
（2）可以理解为未被酶切开的重组质粒；带（3）大小与酶切pUC19质粒大小相似，可以判断为重组质粒酶切后的质粒载体；而带（4）大小在2322bp左右，为酶切开的λDNA片段。
泳道4中，在重组质粒上方又出现了一条带
（1），大小在4316bp左右，可能为酶切开而没有连接上的λDNA片段。
图3重组质粒2酶切对比
（二）重组质粒的PCR验证结果
1.琼脂糖电泳展示的克隆片段的PCR扩增结果如下图：
图4第1-5组重组质粒的PCR验证结果
从左到右各泳道点样如下表所示：
泳道
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
组别
对照
JD-1
JD-2
JD-3
样品
DL2000
plus
564bp
模板
本组
样品
564bp
模板
本组
样品
本组
样品1
本组样品
2
564
模板
pUC19
水
泳道
11
12
13
14
15
16
17
18
组别
JD-4
JD-5
空
对照
样品
564bp
模板
本组样品
1
本组样品
2
564bp
模板
本组
样品
1
本组
样品
2
无
DL2000
plus
从图中可以看出，第8泳道没有条带，这是由于第3组的同学操作失误，忘记加564bp模板造成的。
我所在的组别是第1组，即泳道2、3。
泳道2为564bp模板，泳道3为本组样品中的2号样品。
具体分析如下：
图5中，泳道1为DL2000plus，泳道2为模板564bp，泳道3为本组提取的两个样品中的一个——重组质粒2。
泳道9是以pUC19质粒代替模板PCR扩增产物，泳道10是以ddH2O代替模板PCR扩增产物。
泳道2为564bp模板PCR产物，
显示的条带大小为750bp左右，因为两引物间序列的长度是150bp，所以泳道2显示的条带结果较为理想。
泳道3为本组所提重组质粒2，其酶切图如图6所示。
其中泳道1为λDNA/HindIII，泳道4、5分别为重组质粒及其酶切条带。
泳道5中的带（4）为酶切后的λDNA片段，大小为2322bp。
将此条带进行PCR扩增后，得到的条带即为图5中的泳道三所示条带，此条带在2000bp-3000bp之间，基本与插入片段的大小相符。
泳道9以pUC19质粒代替模板PCR扩增产物作为模板对照。
显示的较明显的条带在100bp-250bp之间，应为150bp的引物序列，是目的扩增片段，泳道9中无其他杂带，结果较为理想。
泳道10以ddH2O代替模板PCR扩增产物作为阴性对照，但出现了弥散性条带，推测可能是引物设计中，出现引物自身配对结合的情况导致的引物二聚体。
图5PCR扩增目的基因结果图
图6本组重组质粒2及酶切图
2.克隆片段的定量计算
量取DNAmarkerDL2000plus条带的迁移距离（如表1所示）。
以迁移距离为横坐标，DNA大小的对数为纵坐标，绘制曲线（如图7所示）。
表1克隆片段大小与电泳迁移距离（以图4为标准）
迁移距离/cm
片段大小/bp
Lg（片段大小）
1.73
5000
3.70
2.07
3000
3.48
2.41
2000
3.30
3.17
1000
3.00
3.47
750
2.88
3.84
500
2.70
4.29
250
2.40
4.70
100
2.00
测得图4中第2、3泳道所示条带的迁移距离分别为3.51cm和2.40cm。
根据标准曲线（R2=0.9785）计算出片段大小分别为660bp和2511bp。
实际片段大小应分别为714bp和2472bp，误差分别为7.6％和1.6％。
图1克隆片段大小与电泳迁移距离
六．注意事项
1.限制性内切酶的酶切反应属于微量操作技术，无论是DNA样品还是酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系；
2.酶切反应的所有塑料制品（Eppendorf管、吸头等）必须是新的，并经过高温灭菌，操作时打开使用，操作过程不要求无菌，但要注意手和空气中杂酶的污染，因此要求环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短Eppendorf管的开盖时间。
3.注意酶切加样的顺序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和DNA，最后加酶。
前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20℃冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液时洗头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液，取出的酶液应立即加入反应混合也得液面以下，并充分混匀。
酶液使用完毕后立即放回冰箱，防止酶的失活。
4.Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T），复性温度=Tm值-（5～10℃），本实验两个引物的Tm分别为64.7℃，57.9℃，选用退火温度为58℃，这是因为在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
5.PCR管的盖子一定要盖紧，以防蒸干。
七．分析与讨论
（一）PCR反应的要素
在PCR反应体系中主要存在5类物质，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1.引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
（1）引物长度：
引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在基因组中可能出现的机率的为1次。
因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸。
典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
（2）引物扩增跨度：
以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
（3）引物碱基：
（G+C）含量以40-60%为宜，（G+C）太少扩增效果不佳，（G+C）过多易出现非特异条带。
A、T、G、C最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（4）避免引物内部出现二级结构，尤其是发夹结构。
两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
（5）引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
（6）引物中有或能加上合适的酶切位点。
被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
（7）引物的特异性：
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：
每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
本次实验所使用的上下游引物M13F、M13R分别与puc19多克隆位点两端的24bp长度的序列配对。
其引物序列分别为（5’-3’）：
M13F/CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；M13R/AGCGGATAACAATTTCACACAGGA。
pUC19载体上两引物之间的长度为150bp，因此目的扩增的片段长度=（多克隆位点插入片段长度+150bp）。
上下游引物的Tm值分别为64.7℃和57.9℃，相差达到6.7℃，基本符合引物设计要求。
2.聚合酶及其浓度
TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌中提纯的天然酶或是大肠菌合成的基因工程酶[3]。
本次实验催化PCR反应的酶量为0.05U/μL，如果聚合酶的浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
3.dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L（本次实验为200μmol/L）。
4种dNTP的浓度应相等，如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。
如果4种dNTP浓度过低会降低PCR产物的产量，而dNTP浓度过高则会与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
4.模板
模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，提取的核酸可直接作为模板用于PCR反应。
模板的量应适中（本实验为0.4ng/μL），。
如果模板的量过低会降低PCR产物的产量，而模板的量过高则会与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
另外，模板纯化程度过低会产生非目的扩增产物。
5.Mg2+
Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在PCR反应中，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
（二）PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
1.温度与时间设置
基于PCR原理三步骤而设置变性、退火、延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物沿模板延伸。
对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。
（1）变性温度与时间：
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93～94℃1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
（2）退火温度与时间：
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，（G+C）含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）
复性温度=Tm值-（5～10℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。
（3）延伸温度与时间：
TaqDNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃150bp/s•酶分子
70℃60bp/s•酶分子
55℃24bp/s•酶分子
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
2.循环次数
循环次数决定PCR扩增程度，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在20～40次之间，循环次数越多，模板、引物特异性下降，聚合酶的活性也会降低。
因而非特异性产物的量随之增多。
本次实验中循环次设定为24次。
（三）扩增产物电泳条带分析
在琼脂糖展示扩增产物时
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