小鼠成纤维细胞原代培养.docx

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小鼠成纤维细胞原代培养

实验—小鼠成纤维细胞得原代培养

一、实验目得

１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。

2。

熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．

3。

了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。

二、实验原理

自１７世纪下半叶RobｅrtHooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养（Cellculture）才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。

细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。

如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。

细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。

细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。

依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．

1.原代培养（pｒimary　culture）就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。

但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：

组织块培养法与消化培养法.

组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。

组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。

消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。

该方法主要使用生物化学手段将较小体积得动物组织中妨碍细胞生长得间质加以分解、消化，使组织中结合紧密得细胞连接松散、相互分离，细胞失去与间质得连接,活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团得悬液，分散得细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。

胰蛋白酶主要适用于一些间质少、较软得组织如上皮、肝、肾与胚胎等，胶原酶主要适用于纤维组织、一些较硬得癌组织等得消化中。

原代培养最大得优点就是,组织与细胞刚刚离体，细胞保持原有细胞得基本性质，生物性状尚未发生很大变化，一定程度上更接近于生物体内得生活状态,可为研究生物体细胞得生长、代谢、繁殖提供有力得手段。

一般说来,幼稚状态得组织与细胞,如动物得胚胎、幼仔得脏器等更容易进行原代培养.

2。

传代培养　（subｃｕlｔure）就是原代培养细胞或细胞株在体外获得稳定大量同种细胞并维持细胞种延续得过程。

当原代培养成功后,培养得细胞通过增殖达到一定数量后,必需对细胞从原培养瓶中加以分离，经稀释后再接种于新得培养瓶中，这一过程即为传代培养,亦称为继代培养或连续培养.

如果原代细胞就是正常细胞,随着培养时间得延长与细胞不断分裂,形成得单层细胞汇合,细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另外，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，加之代谢物积累也不利于细胞生长或发生中毒。

此时，就需要将将培养细胞从原培养器中取出,加以分离,以1∶2或1∶3以上比率转移到另外培养器皿（瓶）内扩大培养,此过程称为传代（paｓｓage）.原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中得细胞世系组成.

细胞传代后一般经三个阶段:

游离期;指数增生期与停止期。

培养细胞得“一代”就是指传代培养得累积次数,其与细胞世代或倍增不同，细胞转移扩大培养得1代中，细胞约能倍增3～6次。

细胞增殖得旺盛程度通常用细胞分裂指数表示，即细胞群得分裂相数/10０个细胞。

一般细胞分裂指数介于０、2%~０、5％,肿瘤细胞可达３～5％。

细胞接种2～3d时分裂增殖旺盛，就是活力最好时期,称指数增生期（对数生长期）,适宜进行各种试验。

　　体外培养细胞与生长类型不同,传代培养得方法也不同。

贴附型生长得细胞要先进行消化，制成细胞悬液再传代;而悬浮型生长得细胞可直接传代,或离心后传代。

3。

细胞活力测定:

在标准化培养与实验条件下，细胞数目及活力测定极其重要。

198３年Moｓmann首次应用ＭＴT比色法检测培养细胞活力。

MTT得化学名称为3—（４,5—二甲基噻唑-2）—２，5-二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝。

其具有接受氢原子而发生显色反应。

检测原理为,活细胞线粒体中得琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢,脱下得H+通过受氢体传递,能使外源性染料MTT还原为不溶性得蓝紫色结晶物,并沉积在细胞中。

细胞中得蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜（DＭSO）中,并表现为一定得色度.用酶联免疫检测仪在４90nm波长处测定其光吸收值,并根据光吸收值得高低判断活细胞数量。

在一定细胞数范围内,光吸收值与活细胞数成正比．死细胞内酶失去活性,故无此功能.该检测方法灵敏度高、重复性好、操作简便、经济安全，具有良好得相关性。

广泛用于一些生物活性因子得活性检测、大规模得抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等．

三、实验物品

1．材料:

乳鼠、、ＨｅLａ细胞（人宫颈癌细胞）。

2。

器材:

超净工作台、解剖器材、酒精灯、离心管、移液管、吸管、烧杯、大平皿、96孔培养板、不锈钢滤网（100目、２00目）、水浴箱、血细胞计数板、培养瓶、ＣO２培养箱、离心机、盖玻片，擦镜纸，香柏油、倒置相差显微镜、显微镜、全自动酶标仪（ｂiｏ—rａd5５0型）。

3。

试剂:

（1）75％乙醇

（2）PＢS液（pH7、2）配方:

　Nacｌ8ｇ、Kcl0、2ｇ、Ｎa2ＨPＯ41、44g、KH2PO４　0、24g　调pH７、4　定容１Ｌ

（3）无钙、镁离子PBS液

（4）Ｄ—HanK液（无钙、镁离子得ＨanＫ液）

（5）消化液（0、25%胰蛋白酶、0、02%EDTA各１份）

（6）0、２5%胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶0、25g、D－Haｎks液100mｌ,pH7、4）

（7）0、4％台盼蓝、

（8）培养液:

ＥMEM培养液（Ｅaｇle’ｓMinｉmｕmＥsseｎtial　ＭedｉuｍEａglｅ氏最低要求培养基）:

ＥMEM8５份，小牛血清15份,加入青霉素、链霉素贮存液1份,使青霉素、链霉素得最终浓度分别为100单位及100nｇ/ｍl．EMEM培养基可选用各种商品供应之粉末培养基，按生产厂商提供资料配制并除茵。

4℃冰箱贮存。

DＭEM（Dulbecco’sModiｆication　ofEagle＇sMedium）:

ＲPMI1640培养液（９0％RＰMI　16４0、10%胎牛血清、双抗（青霉素,链霉素）100单位/ｍl

7、4％NａHCO3调pH至6、8~7、0）

RPＭＩ1640维持液（5%胎牛血清、余同上）

（9）０、５%MTT溶液（５ｍg/ｍｌ）、

MTT0、5g,溶于１0０　ｍl得磷酸缓冲液（PBＳ）,用0、22μm滤膜过滤以除去溶液里得细菌，放4℃避光保存两周内有效。

在配制与保存得过程中,容器最好用铝箔纸包住.最好现用现配。

（1０）二甲基亚砜

（１1）碘伏

四、实验步骤

原代培养

组织块培养法：

1。

动物处死取新生大鼠（出生２~３天）一只，用颈椎脱臼法处死；为避免过多血细胞得干扰,也可采用剪断颈动脉放血得方法处死。

然后，把新生大鼠浸入盛有75%乙醇得烧杯中2-３秒,取出后放在大平皿中携入超净工作台。

2。

取材　用碘酒与75％乙醇再次消毒一次，打开消毒器械包　用镊子新生大鼠腹部皮肤,用解剖剪开腹腔，充分暴露腹腔;用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧得肾脏（右肾略低）;取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中。

（或取出肝组织置于培养皿中。

）

3.剪切　剪开肾膜,剥向肾门,去除肾膜及脂肪；用吸管吸取灭菌PＢＳ（或Hａnks液）将肾脏清洗３次,去除血污;将肾脏移入另一平皿中，沿纵轴剪开肾脏,剪去肾盂,用眼科剪将肾组织反复剪碎,直到剪成0、5~１mm3组织块;用吸管加2～3滴培养液轻轻吹打，使组织块悬浮在培养液中.（或肝组织用Hanks液反复冲洗，以除去血细胞,将肝组织移入另一个培养皿中,用吸管吸取0、5ml培养基置于肝组织上,用另一眼科剪将其剪成0、5~１ｍm３组织块。

）

4。

接种：

用弯头吸管小心分次吸取组织块,使组织块吸在吸管端部,要避免吸得过高,组织块粘附于吸管壁而丢失。

将组织块均匀排布在培养瓶底部,控制组织块间距在０、5cm左右，每2５ｍl培养瓶底可摆布15~20块．轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上,翻瓶时勿使组织块流动,加入2～3ｍl培养液（液层厚约１5mｍ），塞好瓶塞,置CO２培养箱37℃培养2~３h,（勿超过4h）。

此时组织块略干燥，能贴附于瓶壁上。

５、培养：

慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡附于瓶底得组织块,置培养箱中静止培养。

操作过程中动作一定要轻，减少振动，使培养液慢慢覆盖组织块，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。

6.观察　24小时后取出观察，移动培养瓶时要尽量使培养液震荡撞击组织块。

在显微镜下观察已贴壁得组织块有无细胞长出。

消化培养法：

１。

处死动物、取材及剪切:

与组织块培养法相同.剪切后得组织块再用灭菌得PBＳ（或Haｎks液）清洗数次,直到PＢS澄清为止。

移入无菌离心管中,静置数分钟,使组织块自然沉到管底,弃上清。

2。

消化及分散组织块按组织块体积5~１0倍量，吸取0、25％胰蛋白酶－０、０2%ＥDTA混合消化液加到含组织块得无菌离心管中，与组织块混匀后，加盖无菌塞子密封,置37℃水浴中消化１0～２0min,其间每５min摇动一次,使组织块散开并与消化液充分接触．当组织块变得疏松、颜色略白时,从水浴中取出离心管，在超净工作台内静置后吸去含胰蛋白酶得上清（此步骤可以在8０0～1000rｐｍ离心3～5min去除含胰蛋白酶得上清）,加入2～3mｌ培养液,终止消化.用吸管反复吹打,直到大部分组织块分散成单细胞或细胞团状态为止。

最后将此细胞悬液用１00目、２00目得不锈钢滤网过滤至烧杯中。

3计数及稀释:

从过滤得细胞悬液中取1mｌ，用血细胞计数板计数。

根据计数结果，用培养液稀释，稀释后得细胞密度以5×１0５~１×１0６为宜。

4。

接种培养:

将稀释好得细胞悬液分装于培养瓶中,一般2５ml小方瓶分装4～5ｍｌ,青霉素瓶分装1ｍl。

培养瓶上做好标记,培养瓶盖旋紧后再松半个螺旋,置CO2培养箱在３7℃培养。

5.观察:

接种培养后要每日观察培养液就是否污染、颜色变化及细胞生长状况。

培养液黄色且混浊表示污染,紫红色表明细胞生长不良,桔红色表明细胞生长良好.

传代培养

贴壁细胞得传代培养:

1.准备从培养箱中取出原代培养细胞,在显微镜下观察，确认已长成致密单层、生长良好,适宜传代培养。

将培养瓶连同所需实验用品备齐，放入超净工作台内,所有实验操作均在超净工作台内进行。

2、消化弃去原代培养瓶内得旧培养液，加入适量无钙、镁离子PＢS液（或Ｈanks液）,轻轻摇动培养瓶，清洗残留在细胞表面培养液与碎片，弃去清洗液。

在培养瓶内加入消化液（０、25％胰蛋白酶、０、0２％ＥDTA各１份）约２~3mｌ,以液面盖满细胞为宜。

培养瓶置室温或培养箱内2～3min后，在倒置显微镜下观察培养瓶中得细胞,当发现细胞胞质回缩、细胞间间隙增大时，或翻转培养瓶肉眼观察,细胞单层出现针孔大小得缝隙，则快速弃去消化液;如未出现缝隙,则继续消化,直到出现缝隙．向培养瓶中加入PBS液（或Ｈanｋs液）,轻转培养瓶清洗残留得消化液后倒掉PBS液（或Hａnｋs液）。

３。

分装　在培养瓶内加入新配制得培养液约３ｍｌ，并用吸管反复吹打瓶壁,至细胞层全部脱落，再轻轻吹打细胞悬液,使细胞散开。

吹打时应按一定得顺序进行,即从培养瓶底部得一侧开始吹打至另一侧结束,尽量使每个部位得细胞都能被吹到。

吹打时不能太用力,尽量不产生气泡,避免损伤细胞．在倒置显微镜下观察细胞，当贴壁细胞均已悬浮于培养液中,且细胞已分散单细胞或细胞团时，终止吹打。

取细胞悬液计数并用台盼蓝染色,计算细胞密度及细胞活力，据此对细胞悬液补加适量培养液稀释，调整细胞密度为1×105~1×１0６/ml,将其分装到２瓶或多瓶中。

原代培养得细胞首次传代时,细胞密度宜大些，以使细胞尽快适应新得环境，利于细胞生存与增殖。

如原培养瓶为5ｍl培养液，分装2瓶时，则需补加培养液到10ml,混匀后分一半到另一培养瓶中。

在分装好得培养瓶上标明日期、细胞代号等标志。

4。

培养与观察　轻轻摇动分装好得培养瓶，置ＣO２培养箱37℃培养。

接种后要每日观察培养液得颜色及细胞生长状况,通常，细胞传代培养２h左右，细胞即能贴壁生长，2~４h可形成单层。

培养过程中,可通过0、５%台盼蓝染色了解培养细胞中死、活细胞得比例．

悬浮细胞得传代培养：

少数细胞，如某些癌细胞、血液中白细胞,体外培养时为悬浮生长、不贴壁，其传代培养得方法不同于贴壁生长得细胞，可通过离心收集细胞后传代或直接传代。

１。

离心传代　超净工作台内用吸管将培养瓶内得细胞吹打均匀,如有半贴壁得细胞应将其吹打下来。

将细胞悬液转移到无菌离心管中，平衡后800~１0０0/ｍｉn离心5ｍｉn，弃上清，加适量新配制得培养液打匀成细胞悬液．细胞计数，按１：

2或1：

3得比例将细胞悬液稀释，分装于新得培养瓶中进行培养．培养及观察等操作同贴壁细胞得传代培养.

2.直接传代　让悬浮细胞慢慢沉淀到瓶底,弃去上清液１/2～1/3后，用吸管吹打成细胞悬液，其后得操作同上。

培养细胞活力测定

1。

接种细胞:

用０、2５%胰蛋白酶消化ＨeLa细胞，并用培养基制成单个细胞悬液,以5×１０4/mｌ接种于96孔培养板，每孔200μl，5%CＯ2、37℃培养３～5天。

整个实验分为３个组:

加药实验组、不加药对照组及不接种细胞也不加药得空白组。

每组8个复孔。

培养24ｈ实验组加药处理。

继续培养至72h。

2。

染色：

每孔加入２0μl0、5％ＭＴT溶液（5mg/ml）,若实验组所加药物能与MTT反应,应先离心弃去培养液，小心用PBS冲２-３遍后,再加入含MTＴ得培养液。

继续培养4h。

3．离心:

与另一96孔板平衡后,１000r/mｉn,离心１0miｎ　,用力甩去上清。

4.溶解：

每孔加入200μｌ二甲基亚砜,避光振荡１０ｍin,以溶解紫色结晶。

5.测定：

用全自动酶标仪（bio-rad550型）测定波长570nm（49０nm?

）处各孔得吸光值（OD值）.实验组与对照组OD值以空白组ＯD值调零。

6。

计算实验组细胞存活率、抑制率:

细胞存活率越小,说明实验组药物得作用强度越大;抑制率越大，说明实验组药物得作用强度越大。

计算公式如下：

细胞存活率=（实验组OD值／对照组OD值）×1０0%

抑制率=〔（对照组OD值一实验组ＯD值）/对照组OD值〕×100%

五、实验结果与记录

1.组织块法培养细胞得观察

培养2４h后,倒置显微镜下可观察到组织块周围开始有少量得细胞．一般最先长出形态不规则得游走细胞，接着长出成纤维细胞或上皮细胞，随着细胞得延长,组织块周围形成较大得生长晕，以后细胞生长加快，呈放射状向外扩展逐渐连成一片（图7-1）.即有少量细胞从组织块周围游离而出,当细胞从组织块游出量增时,应根据培养液颜色,补加或更换培养液。

培养液表面如有漂浮得组织块,要及时吸弃。

细胞生长良好时,10～15天可长成致密单层,需传代培养。

图７—1组织块周围细胞呈放射状向外扩展

2。

胰蛋白酶消化法培养细胞得观察

正常情况下,倒置显微镜下可观察刚接种得细胞均呈圆形悬浮于培养液中,接种24ｈ后可见许多细胞贴壁，细胞由圆形悬浮状态伸展成梭形（图7—2，图7—3）;若细胞生长不良或培养液变红,应在无菌条件下，更换培养液.培养３~4ｄ时,细胞增殖旺盛,数量增多,细胞透明,颗粒少,界限清楚,可见细胞岛形成;此时若培养液变黄、澄清，表明细胞生长,但营养成分不足,代谢产物堆积，ＣＯ2增多,可更换1/2新培养液或维持液.此后,每3～４d，更换新培养液或维持液。

维持液与培养液得差别仅在于血清量为５%．通常在７～１０d，细胞基本形成致密单层，可进行传代培养。

图7—2细胞由圆形悬浮状态伸展成梭形并贴壁

图7—3扫描电镜观察到贴壁细胞得三维构造

六、注意事项

细胞培养得无菌操作要求

准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大，应给予足够得重视,推备工作中某一环节得疏忽可导致实验失败或无法进行。

准备工作得内容包括器皿得清洗、干燥与消毒,培养基与其她试剂得配制、分装及灭菌，无菌室或超净台得清洁与消毒，培养箱及其她仪器得检查与调试

1.器材与液体得准备

细胞培养用得玻璃器材,如:

培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒与铁筒中,12０℃,2小时干烤灭菌后备用;手术器材、瓶塞、配制好得PBS液用灭菌锅15磅,20mｉn蒸气灭菌;培养液、小牛血清、消化液等用G6滤器负压抽滤后备用．

2。

无菌操作中得注意事项

在无菌操作中,一定要保持工作区得无菌清洁．为此,在操作前要认真地洗手并用75%乙醇消毒。

操作前２0~30min起动超净台吹风。

操作时，严禁说话,严禁用手直接拿无菌得物品,如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。

培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒,打开后与加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后得操作全部都要在超净台内完成．操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。

使用得吸管在从消毒得铁筒中取出后要手拿末端,将尖端在火上烧一下,戴上胶皮乳头,然后再去吸取液体。

总之,在整个操作过程都应该在酒精灯得周围进行.

3。

用灭菌得PＢＳ（或〈,,SPAN　ｌａng=EＮ-UＳ〉Hａｎｋs液）清洗组织块时冲洗要充分,尽量去除血细胞,避免其溶血后对培养细胞得生长产生影响