泻火补肾汤对移植入脑出血大鼠脑内的神经干细胞存活分化的影响.docx

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泻火补肾汤对移植入脑出血大鼠脑内的神经干细胞存活分化的影响

泻火补肾汤对移植入脑出血大鼠脑内的神经干细胞存活分化的影响

【摘要】观察泻火补肾中药复方对移植入脑出血大鼠脑内的神经干细胞存活分化的影响，并探讨其促进被移植干细胞存活的机制。

方法：

分离新生SD大鼠海马获得NSCs，筛选群体反应性抗体阳性SD大鼠并复制脑出血模型，将5溴脱氧尿嘧啶核苷标记的NSCs移植入脑出血大鼠脑内。

移植灌胃组用泻火补肾汤煎剂灌胃干预，移植组、脑出血组蒸馏水灌胃。

用逆转录聚合酶链式反应法检测大鼠脑内干扰素γ、白细胞介素4mRNA表达；免疫荧光双标记法检测移植NSCs的大鼠脑内BrdU及NF200双阳性细胞。

结果：

移植灌胃组大鼠脑内IFNγmRNA的表达下调，而IL4mRNA的表达增强，BrdU及NF200双阳性细胞增多。

结论：

泻火补肾方药促进移植的NSCs存活分化可能与诱导IL4而抑制IFNγ的表达有关。

【关键词】泻火补肾方;神经干细胞;干扰素γ;白细胞介素4;大鼠

　　Objective:

ToinvestigatetheeffectsofXiehuoBushenDecoction（XHBSD）,acompoundChineseherbalmedicine,onthesurvivalanddifferentiationoftransplantedneuralstemcells　inbrainsofratswithintracerebralhemorrhage,andtoexplorethemechanismofXiehuoBushenformulainpromotingthesurvivaloftransplanted:

NSCsseparatedfromhippocampusesofneonatalSDratswerecultured.Sixtyfivepanelreactiveantibody（PRA）positiveSDratswereselectedbylymphocytotoxicitymethods.ThePRApositiveratsweremadeintointracerebralhemorrhagicmodelanddividedintothreegroups:

cerebralhemorrhagegroup（n=15）,NSCstransplantedgroup（n=25）andXHBSDgroup（n=25）.XHBSDwasorallyadministeredafter5bromodeoxyuridine（BrdU）markedNSCsweretransplantedinbrainsofratswithintracerebralhemorrhageintheXHBSDgroup.Ratsintheothertwogroupswereadministereddistilledwater.Theexpressionsofinterferongamma（IFNγ）andinterleukin4（IL4）mRNAsweremeasuredbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction（RTPCR）;thenumbersofBrdUand200kDneurofilament（NF200）positivecellsweredetectedbydoublelabelingimmunofluorescence:

TheexpressionofIFNγmRNAwasdownregulatedsignificantlyintheXHBSDgroup,buttheexpressionofIL4mRNAwasupregulatedsignificantly（）.ThenumbersofBrdUandNF200positivecellswerealsoincreasedremarkablyintheXHBSDgroup.Conclusion:

XHBSDcanpromotethesurvivalanddifferentiationoftransplantedNSCs,whichmayberelatedtoinducingtheexpressionofIL4mRNAandinhibitingtheexpressionofIFNγmRNA.

　　Keywords:

XiehuoBushenDecoction;neuralstemcells;interferongamma;interleukin4;rats

　　神经干细胞具有无限增殖和多分化潜能［1］。

NSCs移植治疗脑出血，促进缺失的神经功能恢复具有临床应用前景。

研究表明，NSCs在一定条件下表达主要组织相容性复合物分子，具有免疫原性［2,3］；同时脑出血后血脑屏障损伤，脑的“免疫豁免”状态破坏，NSCs移植治疗脑出血时免疫排斥完全可能发生［4,5］。

保证NSCs移植成功必须首先避免免疫排斥。

CD4+辅助性T淋巴细胞不同亚群在移植免疫中通过其分泌的细胞因子各自发挥着独特作用：

Th1细胞分泌的γ干扰素、白细胞介素2等参与介导移植排斥反应［6］；Th2细胞分泌的IL4、IL10等则抑制CD4+Th细胞向Th1细胞分化，易于诱导移植耐受［7］。

因此，定向调控Th细胞分化，成为诱导移植免疫耐受的策略之一。

本实验从Th1/Th2偏移入手，观察Th1/Th2典型的细胞因子IFNγ与IL4mRNA表达，并检测移植入脑出血大鼠脑内的NSCs存活分化情况，研究以清热泻火、凉血活血、养阴益气、补肾益精为组方大法的泻火补肾汤能否诱导免疫耐受，促进移植的NSCs存活及其可能机制。

　　1材料与方法

　　实验材料

　　试剂和仪器

　　达尔伯克改良伊格尔培养基/F12Ham‘s基础培养基为HyClone公司产品，碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27添加剂、小鼠抗巢蛋白抗体、小鼠抗5溴脱氧尿嘧啶核苷及小鼠抗神经微丝200单克隆抗体均为Chemicon公司产品；TRIzolRNA抽提试剂盒，美国Invitrogen公司产品；逆转录聚合酶链式反应一步法试剂盒，FermentasLifeSciences公司产品；SWCJIF超净工作台，苏州净化设备厂生产；QWJ300TVBB型CO2培养箱，美国QUEUESYSTEMS公司生产；OLYMPUSIX71荧光倒置显微镜，日本OLYMPUS公司生产；超低温冰箱、PCR热循环仪及恒冷切片机，美国Thermo公司生产；STOELTINGTL2型鼠脑定位仪，美国STOELTING公司生产；TanonGIS2020凝胶图像处理系统，上海天能公司生产；Ⅶ胶原酶，美国Sigma公司产品。

　　实验动物

　　新生3dSD大鼠4只，雌雄不限，体质量g；成年SD大鼠95只，雌雄不限，空腹体质量220～250g，上述动物均由中南大学实验动物学部提供，为SPF级。

许可证号：

SCXK20060002。

　　泻火补肾方药制备

　　中药复方泻火补肾汤由制大黄、牡丹皮、白芍、黄芪、菟丝子、桑寄生等药组成。

购自湘雅医院药剂科。

药材用蒸馏水漂洗干净，用三蒸水约400ml煮沸30min煎取头煎，再加三蒸水400ml煎取第2煎，2煎药混匀，煮沸浓缩使药液浓度为1g/ml，分装小瓶，储于4℃冰箱备用。

　　实验方法

　　NSCs的分离培养鉴定及标记

　　取新生3d的SD大鼠4只，75％酒精浸泡消毒，颈椎脱臼处死，参考Jasodhara等［8］方法，取出大脑，分离海马，去除脑室膜，机械分离成单细胞，用DMEM/F12培养液置37℃、5%CO2的培养箱中培养。

每2d半定量更换培养基，10d左右用机械消化法传代。

第2次传代后向培养基中加入10μmo1/L的BrdU，48h后，取细胞悬液少许滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，自然晾干后行nestin及BrdU免疫荧光染色，荧光显微镜观察并照相。

　　群体反应性抗体值的测定

　　SD大鼠30只，腹腔麻醉取脾，剪碎置无菌平皿内不锈钢网上，碾磨过滤成细胞悬液，将悬液移至淋巴分离液，离心收集淋巴细胞，用1640培养液调整细胞密度为2×106/ml。

另取备选SD大鼠，断尾采血并分离血清，分别按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32稀释血清。

于72孔滴定板每孔中依次加入8μl石蜡油、1μl血清和1μl淋巴细胞，进行补体依赖的细胞毒实验［9］，倒置显微镜下观察死、活细胞数。

计算视野中死细胞数和细胞总数的百分比即群体反应性抗体值，参照Hooper等［10］的方法分为非致敏、致敏及高敏3级，筛选出PRA阳性大鼠65只。

　　动物分组及处理

　　将65只PRA阳性SD大鼠制备脑出血模型，随机分为脑出血模型组15只、移植组25只和泻火补肾汤治疗组25只。

模型制备参照Rosenberg等［11］的方法。

大鼠腹腔麻醉后，固定于鼠脑立体定位仪。

按无菌操作规程，消毒皮肤，切开头皮，分离骨膜，暴露颅骨，行苍白球定位，用5μl微量注射器在2min内注入UⅦ胶原酶灭菌生理盐水溶液μl，留针5min，针头后退mm，再留针5min后拔针，缝合皮肤，局部络合碘消毒。

蒸馏水4ml灌胃，2次/d。

移植组和泻火补肾汤治疗组大鼠于脑出血模型造模完毕后第2天行神经干细胞移植，参照Nonaka等［12］的方法，调整鼠脑立体定位仪行同侧脑室下区定位。

微量注射器抽取5μlBrdU阳性的细胞悬液，垂直进针，以1μl/min的速度缓缓注入悬液，留针5min，缓慢拔针，消毒缝合皮肤。

造模及移植成功，待大鼠清醒后，移植组予蒸馏水4ml灌胃，2次/d。

泻火补肾汤治疗组予泻火补肾汤灌胃，每次4ml，2次/d。

各组分别于移植术后2、4、7、14、21d随机取3只大鼠用于RTPCR检测；移植组和移植泻火补肾汤灌胃组分别于每时点另取2只大鼠用于免疫荧光双标记检测。

　　RTPCR检测IFNγ和IL4mRNA的表达

　　断头处死大鼠，立即取脑，放入焦碳酸二乙脂处理过的玻璃匀浆器，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，常规方法将RNA逆转录成cDNA，再进行PCR扩增。

其中IFNγ上游引物为5’GTCATCGAATCGCACCTGATCAC3’，下游引物为5’CCGATGTATAGACATTCCTCTGG3’，扩增片断长度为532bp；IL4上游引物为5’ATGCACCGAGATGTTTGTACC3’，下游引物为5’ATGCACCGAGATGTTTGTACC3’，扩增片断长度为220bp；βactin上游引物为5’ACTCCTACGTGGGCGACGAG3’，下游引物为5’CAGGTCCAGACGCAGGAGGC3’，扩增片断长度为312bp。

引物由上海生工公司合成。

PCR扩增时所有cDNA95℃预变性10min，94℃变性30s，IFNγ60℃，IL455℃退火40s，72℃延伸30s，共30个循环。

最后72℃再延伸10min，4℃保存。

取出10μl反应产物，%琼脂糖凝胶电泳，电压80V，25min，Tanon凝胶图像处理系统测定各条带光密度值，用平均光密度值与各组βactin光密度平均值之比表达各指标的mRNA表达水平。

　　免疫荧光双标记检测NF200和BrdU的表达

　　移植组与泻火补肾汤治疗组大鼠的脑组织在各时间点进行灌注、固定和沉底，入恒冷切片机行连续冠状切片，厚30μm，收集脑组织裱于明胶化载玻片上，置－20℃冰箱中备用。

将－20℃内保存的切片于37℃复温60min，用50%甲醛/2×氯化钠柠檬酸钠（sodiumchloridesodiumcitrate,SSC）缓冲液65℃预处理2h，2×SSC5min×4，2mol/LHCl37℃30min，5%BSA封闭37℃1h后，用BrdU单克隆抗体行四乙基若丹明异硫氰酸盐（tetraethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）染色，切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在80℃烤箱以甲醛蒸气固定2～4h，然后用NF200抗体行异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）染色。

以上各步前后均用mol/LPBS漂洗，5min×3次，常规脱水、透明、封固。

荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光观察切片组织内TRITC及FITC所标示的BrdU抗原及NF200抗原，观察侧脑室下区BrdU及NF200阳性细胞并照相。

　　统计学方法

　　采用SPSS软件处理，各组数据均以x±s表示，组间两两比较用最小显着差异（leastsignificantdifference,LSD）t检验或Dunnettt检验，检验水准α=。

　　2结果

　　海马成体NSCs的分离培养及鉴定

　　将从海马分离的细胞接种到DMEM/F12培养液中，2d后大部分细胞死亡，10%细胞贴壁，其后形成2～4个细胞团，10d后长成大小不一的细胞团，形态规则或成桑葚状，悬浮生长，即神经球，经细胞免疫荧光化学检测均为nestin及BrdU抗原阳性。

证明其为NSCs，且具有增殖能力。

见图1和2。

　　PRA值测定

　　曙红染色，倒置显微镜镜下观察淋巴细胞发现，淋巴细胞形态大致可分为两种：

体积明显增大，折光性极弱，如“煤球状”，或体积无明显变化，折光性强，如“星星状”。

计算死活细胞数得出PRA值，其结果显示SD大鼠群中存在致敏及高敏大鼠，可筛选作为理想的移植排斥动物。

见图3。

　　泻火补肾方药对行NSCs移植术后脑出血大鼠脑内IFNγ和IL4mRNA表达的影响

　　RTPCR显示，各组IFNγmRNA的表达于移植术后第2天最高，并随时间推移表达逐渐减弱；第4和第7天泻火补肾汤治疗组IFNγmRNA表达低于移植组；泻火补肾汤治疗组IL4mRNA表达逐渐增强，第7天IL4mRNA表达达到高峰，与模型组与移植组比较差异有统计学意义。

见图4、5和表1。

表1IFNγ和IL4mRNA在移植术后各时间点的表达

　　泻火补肾方药对移植入脑出血大鼠脑内的NSCs存活分化的影响

　　免疫荧光双标法显示，移植后各时间点，移植组大鼠侧脑室下区BrdU阳性细胞数目极少，NF200阳性细胞几乎未见表达，其位置多分布在侧脑室下区进针区周围；与移植组相比，移植灌胃组大鼠侧脑室下区BrdU、NF200双阳性细胞数目增多，阳性细胞表面可见细长突起，且此形态随时间推移渐趋明显。

这说明泻火补肾方药可促进被移植入受体的外源性NSCs存活分化。

见图6。

　　3讨论

　　脑出血为脑血管病中的危急重症，致残率和死亡率极高，至今尚缺乏有效的治疗措施和药物。

脑出血后，出血灶中心区的神经细胞死亡导致神经功能的缺损，而机体自身的NSCs在应激状态下主动增殖分化，在一定程度上对损伤进行修复［13］。

但中枢神经系统中神经干细胞存在的数量有限，不足以弥补神经元的缺失，因此开展细胞替代治疗已成为研究的发展趋势。

　　在NSCs移植治疗中，同种自体移植往往受到来源的限制，多数情况下只能依赖同种异体来源的干细胞。

研究发现原代NSCs无MHC分子表达，但随着体外传代次数的增加，其表面开始表达MHCⅡ类分子，存在移植排斥反应发生的可能［14］。

因此，同种异体NSCs移植必须首先避免移植排斥。

在移植免疫应答中，一般认为Th1型细胞因子参与介导排斥反应，而Th2型细胞因子可拮抗Th1细胞并抑制细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicityTlymphocyte,CTL）的功能，从而诱导移植耐受［15］。

　　IFNγ和IL4分别是Th1与Th2细胞所分泌的代表性的细胞因子，在Th1/Th2分化偏移过程中发挥着独特作用。

Th0向Th1/Th2分化的关键事件，是IL12受体β链第二个亚单位的表达，以及由IL12Rβ2受体启动的信号传导。

IL12Rβ2的表达受IFNγ和IL4的正负调节。

IFNγ和IL4能分别促进Th1和Th2的分化并抑制对方的表达［16］。

因此，若能增强IL4表达，抑制IFNγ的作用，从而上调Th1和下调Th2表达，无疑有助于移植耐受的形成。

　　泻火补肾汤是本研究所黎杏群教授源于对流产的认识，结合多年治疗脑出血研究及解决神经干细胞移植治疗后排斥反应的科研经验方。

黎教授从中医学角度阐释干细胞移植认为：

NSCs来自父母，肾精化生，实为胎元新生之体。

抑制NSCs移植排斥，诱导免疫耐受，中医学当以“保胎”立法。

NSCs为纯阳之物，植入受体出血性中风之体，其本已虚，多为肝肾阴虚、肝阳偏亢，两阳相合、火自内生、火热伤阴耗气，血脉瘀滞、气血两虚。

故治法以清热泻火、凉血活血、养阴益气、补肾益精，以《医学衷中参西录》之保胎经典方剂“寿胎方”为基础化裁，选《神农本草经》首载保胎要药桑寄生为君而拟泻火补肾汤，用大黄清热泻火，牡丹皮、生地黄凉血活血，白芍养阴，黄芪益气，菟丝子补肾益精，桑寄生补益肝肾、补血活血，以调整阴阳平衡。

　　我们通过PRA实验筛选出致敏及高敏大鼠，复制脑出血大鼠模型，行NSCs移植，并用泻火补肾汤干预发现，与单纯移植组相比，中药复方泻火补肾汤能促进IL4mRNA表达而抑制IFNγmRNA表达，使Th细胞向Th2偏移，有利于避免移植排斥的不利影响；同时，通过BrdU及NF200免疫荧光双标检测，我们发现移植的NSCs在泻火补肾汤治疗组的存活和分化明显优于单纯移植组，说明中药复方泻火补肾汤能通过抑制移植排斥而促进移植的NSCs在受者脑内存活与整合。

　　中药复方泻火补肾汤诱导免疫耐受，促进NSCs移植成功的可能机制还可从以下方面考虑，如增强宿主细胞Fas配体的表达；抑制血管内皮损伤因子血管细胞黏附分子1的分泌和上调转化生长因子β的表达等。

本实验只是从Th1/Th2偏移入手，观察了Th1/Th2典型的细胞因子IFNγ与IL4mRNA表达以及移植入脑出血大鼠脑内的NSCs存活分化，因此还有待于进一步的研究。

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