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枸杞多糖的生化分析和降血糖活性

摘要：

本实验研究了枸杞多糖的纯化，表性特征和降血糖活性。

通过超滤膜分离获得水溶性多糖（LBP），并通过DEAE纤维素柱和Sephadex的色谱法进一步纯化G-150得到LBP3a和LBP3b。

分析表明LBP3b的平均分子量（Mw）为4.92kDa。

单糖组成分析显示，LBP3b由摩尔比为5.52：

5.11：

28.06：

1.00：

1.70的甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖和木糖组成。

并通过UV，FTIR，NMR和SEM研究了LBP3b的初步结构特征。

体外细胞实验显示，LBP3b以剂量依赖的方式显著抑制葡萄糖的吸收。

研究表明LBP3b具有作为抗糖尿病药物的潜在用途。

1.引言

糖尿病（DM）是指具有异常高水平的血糖的慢性代谢病，已经成为世界上主要的健康问题。

它是由胰岛素分泌缺乏或器官对胰岛素的反应减弱引起的。

包括1型和2型在内的DM在全球发病率急剧增加，到2030年估计超过4亿。

许多口服降糖药，如双胍类和磺酰脲类可用于治疗糖尿病，但这些药物是化学合成的，缺乏多剂量方案，且高成本，具有不良副作用和毒性。

因此，研究和发现新型更安全和更有效的替代品是至关重要的，其中传统的食用和药用资源已成为研究低血糖活性的焦点]。

枸杞，属于茄科，是中国著名的草药，已使用了2300多年。

目前，枸杞受欢迎的功能食品已被广泛使用，其具有很大功效，如减少血糖和血清脂质，滋养眼睛，肾脏和肝脏，抗辐射，提高免疫力，抗衰老，抗癌，抗疲劳，增强血细胞生成，改善男性不育。

据报道，枸杞果干中有胡萝卜素，氨基酸，微量矿物质，维生素，脂肪酸，多糖和甜菜碱与健康相关的生物活性成分。

在枸杞的这些化学成分中，最好研究的组分是水溶性的多糖（LBP）估计占干果的5-8％。

许多关于药理学和光化学的研究已经证明LBP是以上的生物活性的主要成分之一[15-17]。

然而，由于LBP的结构复杂性，不同的提取和纯化方法得到的LBP具有不同组分，结构和功能。

而每种LBP的结构和功能从未进行过全面和深入的讨论。

本研究通过超滤膜分离方法从枸杞果实中提取粗LBP，通过DEAE离子交换纤维素和Sephadex凝胶过滤的方法纯化粗LBP，使用前柱衍生高效液相色谱法鉴定单糖组成，然后确定LBP亚基的结构。

此外，进行体外细胞实验以评价LBP3b的降低血糖的效应。

部分（LBP3b）通过UV，FT-IR，NMR和SEM测定表型特征。

2.材料和方法

2.1.材料和化学物质

枸杞果实在宁夏回族自治区市场购买。

将植物材料干燥并在使用前储存在干燥的地方。

DEAE-纤维素，SephadexG-150，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖，甘露糖，木糖和三氟乙酸（TFA）购自Sigma。

所有其他化学品和溶剂均为分析等级。

2.2.粗多糖的制备

多糖通过Yin和Dang的方法制备。

将枸杞果实的干果用搅拌器粉末化，并将研磨的样品浸入给定体积的60℃的热水中。

在一定条件下，混合的提取物通过有机膜进行超滤，其分离分子量从300至50kDa（从SuntarMembraneTechnologyCo.，Ltd.，Xiamen，China获得）。

超滤后用氯仿：

甲醇（2:

1）（v/v）的过滤液回流三次，以除去脂质。

过滤后，将残余物风干，然后再次用80％乙醇回流。

混合的滤液依次用95％乙醇，100％乙醇和丙酮沉淀。

过滤和离心后，收集沉淀物并真空干燥，得到粗LBP（CLBP）的粗多糖（糖缀合物）。

2.3.CLBP的分离和纯化

CLBP用Sevag试剂脱蛋白3次，然后将所得多糖溶液冻干以得到粗产物。

将粗产物溶解并经受DEAE纤维素柱（OH-，2.6cm×90cm），并用蒸馏水和0.05-0.5mol/lNaCl以30ml/h的流速洗脱。

通过自动级分收集器收集洗脱液并测定280nm处UV吸收和490nm的苯酚硫酸量。

并且获得称为LBP1，LBP2，LBP3和LBP4的四个均匀子级分。

其中含量最高的亚级分LBP3，使用SephadexG-150柱（2.5cm×60cm）进一步纯化。

经离心，浓缩和冷冻干燥后，LBP3b用于后续实验。

通过苯酚-硫酸法[22]，使用d-葡萄糖作为标准样品，测得LBP3b的总糖含量为96.53％。

2.4.单糖组成和分子量测定的分析

LBP3b样品用三氟乙酸（TFA）水解，并由1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生。

LBP3b的单糖组成在ZORBAXEclipseXDBC18柱（250mm×4.6mm，Agilent，USA）上通过反相液相色谱（Agilent1260，VWD检测器，美国）进行，流动相0.1mol/lPBS（pH6.7）：

乙腈为83:

17，流速1ml/min，温度30℃，进样体积为10μl。

检测在250℃nmd-甘露糖，l-鼠李糖，d-葡萄糖，d-半乳糖，d-木糖，d-阿拉伯糖用作参考。

通过高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定LBP3b的平均分子量，将样品溶液置于装有ShodexOHpakSB-802HQ和ShodexOHpakSB-805HQ柱（8.0mm×300mm，ShowaDenko，Japan）的Agilent高效液相色谱（HPLC），用含有0.2mol/lNaCl的0.1mol/l磷酸盐缓冲液（pH5.5）洗脱，其流速为0.8ml/min，并通过Agilent1260折射率检测器检测。

并用用已知分子量的葡聚糖P-82系列作为标准品（805000,339000,210000,48800,2700，10000，6000，180Da），制作标准曲线。

参照上述制作的标准曲线，估算LBP3b的分子量。

2.5.紫外和FT-IR分析

将均匀的LBP3b溶解稀释至适当的浓度，并用UV分光光度计（CARY50UV-vis，Agilent，USA）对其测定。

测定范围从200至500nm。

同时用配备有OMNIC软件的傅里叶变换红外分光光度计（NEXUS870，USA）测定LBP3b的FT-IR。

将LBP3b样品分别用KBr粉末研磨，然后压制为用于在4000-400cm-1的频率范围内进行变换红外光谱测量的粒料。

2.6.NMR分析

通过冻干将多糖与DMSO中的氘交换三次。

并在NMR波谱仪（BruckerAVANCEIII）上于600MHz记录1H和13CNMR光谱。

2.7.扫描电子显微镜

将多糖用金箔涂覆，并在高真空条件下，于5kV的加速电压下，用扫描电子显微镜系统（HitachiS-3400N，Japan）检测，并将图像放大500至10000倍。

2.8.LBP3b对Caco-2细胞培养模型中葡萄糖吸收的影响

细胞培养：

从中国科学院（上海，中国）生物化学与细胞生物学研究所的

细胞库得到了Caco-2细胞，细胞在含有10％胎牛血清DMEM培养基的25cm塑料瓶中生长。

将它们置于37℃，5％CO2和85-90％相对湿度的的环境中培养，每隔一天更换培养基。

指数生长的细胞用于实验。

并根据每个孔一定量的菌体浓度接种，将细胞接种在培养板上的Transwell聚碳酸酯膜中（Corninig，3413）。

在第一周期间每隔一天更换培养基，之后，每天一次，培养时间为19-21天。

通过用Millicell-ERS（MilliporeCorp.）测量的跨膜电阻值评价单层完整性。

单细胞层的TEER≥300cm。

说明细胞的生长是封闭膜，因此可以用作肠吸收的体外模型。

葡萄糖摄取测定：

除去上述Caco-2单层细胞模型的培养基。

用2mlHBSS（pH7.2）洗涤细胞两次，第二次洗涤时于CO2培养箱中静置20分钟。

根据实验组，将适量的葡萄糖和LBP3b溶于HBSS，过滤灭菌，在使用前加热至37℃。

MTT测定法用来测试LBP3b对Caco-2细胞的毒性。

混合葡萄糖和（或者）混有HBSS的LBP3b，连接0.1ml至AP侧，向BL侧加入0.7mlHBSS作为进料流体，并将它们放置在孵化器中。

在此期间，吸出AP侧的液体来检测过量的葡萄糖。

根据课程的数量，在小房间中将等量的液体再次放入AP侧。

葡萄糖的浓度通过葡萄糖氧化酶法估算，通过其在培养基中的减少量来计算葡萄糖的吸收量并且用mmol/l来表达。

管号管号

图1.LBE在DEAE-纤维素柱上的洗脱曲线（A）;LBP3在SephadexG-150柱上的洗脱曲线（B）。

2.9.统计分析

所有组的数据都用SPSS18.0软件来统计评估，通过方差（ANOVA）的单向分析来进行统计分析，区别测试和对照研究的方法的意义由学生的t检验确立，P值小于0.05被认为是显着的，所有结果表示为每组的平均值为±SD（n=5）。

3.结果与讨论

3.1.提取CLBP

称为CLBP的粗多糖从L.barbarum果实通过超滤膜分离的方法萃取出来。

根据个人的因素实验的结果，正交实验表明影响膜通量的主要因素是物质的温度和操作压力。

考虑到膜的使用寿命和生产成本，综合这些因素，结果表明最优的工艺温度是30℃，使用中性物质的工作压力为0.25MPa。

3.2.CLBP的纯化

按照上面所述从大麦杆菌L.中分离CLBP。

在流速0.5ml/min条件下，将CLBP在带有蒸馏水和0.05-0.5mol/lNaCl的DEAE纤维素柱（OH-，2.6cm×90cm）上纯化，通过自动馏分收集器收集洗脱液并通过在280nm条件下的UV吸收进行监测以及在490nm下测定苯酚硫酸。

将洗脱物分成四部分，分别命名为LBP1，LBP2，LBP3和LBP4（图1A）。

使用SephadexG-150进一步纯化亚级分LBP3柱（2.5cm×60cm），得到另外两种纯化的组分，命名为LBP3a和LBP3b（图1B）。

从洗脱曲线来看，多糖（490nm）和蛋白质（280nm）的洗脱峰通常发生在相同位置。

这表明多糖可以与蛋白质组合存在。

3.3.LBP3b的分子量和单糖分析

LBP3b的HPGPC如图2所示。

根据基于P-82系列葡聚糖标准[log（MW）=0.00228t3-0.24764t2+8.58241t-90.4349（R2=0.9961，t=36.716min）]的标准曲线测定，其分子量为4.92kDa。

通过柱前衍生化高效液相色谱分析LBP3b中的单糖组成。

LBP3b的单糖组成在标准糖的HPLC保留时间的基础上来分析（图3A）。

很明显，有六种标准单糖组合物被鉴定了，从低到高，D-甘露糖的保留时间为11.618min，鼠李糖为15.435分钟，d-葡萄糖为22.474分钟，d-半乳糖为25.225分钟，d-木糖为26.898分钟，并且d-阿拉伯糖为27.493分钟。

根据这个规则，LBP3b主要由D-甘露糖，1-鼠李糖，d-葡萄糖，d-半乳糖和d-木糖组成，摩尔比为5.52：

5.11：

28.06：

1：

1.70。

这个结果可能与之前报道的从同一物种分离的LBP有很大不同，表明它们在结构上有所差异，这可能是由于植物收集来源的不同，分离程序的不同，或可能是确定单糖比的方法不同。

图2.LBP3b的HPGPC光谱

图3.LBP3b单糖组成的HPLC色谱图。

LBP3b中的六种标准单糖（A）和组成单糖的PMP衍生物的HPLC色谱图（B）。

3.4.紫外分析

在图4A中显示了在200-500nm范围内的LBP3b的UV光谱。

它在大概200nm处显示出比较强的吸光度，但是在280nm处的吸光度比较弱，进一步表明LBP3b样品含有微量的蛋白质;同时，在UV光谱中的260nm情况下没有吸收，表明不存在核酸。

3.5.傅里叶变换红外光谱分析

LBP3b的FT-IR光谱如图4B所示。

它揭示了典型的碳水化合物吸收峰特征。

对于-OH，-NH2或-NH-基团光谱在3426.6cm-1处显示出典型的主要宽的伸展峰。

在2927.2cm-1处的弱带显示出-CH2-的CH伸缩振动。

在1641.3cm-1的谱带是因为于NH（CONH）可变角振动，这证明多肽或蛋白质的存在与多糖联合在一起。

在1407.1cm-1处的谱带是由于C0（COOH）或CN伸缩振动，1158.4cm-1处的谱带是由于OH（COOH）可变角振动。

在1046.5-1158.4cm-1处的吸收为C0C糖苷环的分配不对称振动，表明存在吡喃糖。

在866.1cm-1处的谱带是在多糖的β-二吡喃葡萄糖的特征，以及在775.5cm-1几乎看不到的肩表明存在吡喃糖的β-异构体。

然而，特别是在LBP3的964.8cm-1的峰用于推断在脱氧核苷酸糖中的鼠李糖末端（CH2）的位置。

3.6.SEM分析

LBP3b的SEM图像如图5所示。

不同放大倍数的显微照片提供了多糖的表面形态。

图5A显示LBP3b具有带有网状结构的球形形状;粒子主要是纤维状的不规则的形状和尺寸。

图5B和C显示球形糖颗粒的聚集体，其具有类似云的粗糙表面，具有大的特征的皱纹。

图5D显示聚集体的局部具有均匀性和光滑表面。

图5D显示聚集体的局部具有均匀性和光滑表面。

结果表明，多糖的形状和结构或表面拓扑可能受到通过提取和纯化或制备产品的方法所影响。

3.7.NMR分析

LBP3b的1H和13CNMR光谱如图6所示。

从1HNMR谱来看，大部分质子共振峰信号在3.0-4.0ppm出现，这比较很难分析。

通常选择ı5.0ppm处的信号以判断异头碳类型。

残余物的异头质子信号超过5.0表示其是π-连接部分。

1HNMR光谱（图6A）显示在ı5.50和4.59ppm之间存在四个异头质子信号。

信号在5.50，5.14，4.91和4.59ppm被归属于α-吡喃鼠李糖的端基质子，β-吡喃葡萄糖，β-吡喃葡萄糖和β-半乳吡喃糖。

从2.89ı4.28ppm的信号归属于

H2-H6。

样品中残留DMSO的信号出现在2.51ppm。

在异头质子指派的基础上，异头碳信号比较容易分配于13CNMR光谱。

LBP3b的13CNMR光谱（图6B）

显示ı97.36和104.59ppm之间的端基异构峰，表明两者在LBP3b中都存在（ı95-103ppm）和（ı104-105ppm）端基异构体。

这个结果与FT-IR光谱一致。

Glc的异头碳信号大概1在04.59ppm左右，这表明多糖的构型是β-葡聚糖。

在5.20ppm处没有信号（图6A），这和上述的结果一致。

在97.36,98.50,102.45和104.59ppm的信号分别是α-吡喃葡萄糖，β-吡喃葡萄糖，β-吡喃甘露糖和β-半乳吡喃糖残基[18,30-32]。

通过上述分析，LBP3b由于其五种单糖的组成，所以具有极其复杂的结构特征。

D-甘露糖，l-鼠李糖，d-半乳糖和d-木糖

的组成都小于LBP3b的6％，这导致它的详细的结构表征难以描述。

在这个部分，几个在UV，FT-IR，1HNMR和13CNMR的光谱中的典型峰证实了单糖的组成。

结论是LBP3b由呋喃和吡喃环组成。

图4.LBP3b的UV（A）和FI-IR（B）光谱

图5.LBP3b的SEM图像。

（A）500×，（B）1000×，（C）1500×，（D）10000×

3.8.Caco-2细胞培养模型中的葡萄糖消耗测定

一定浓度的LBP3b对不同浓度的葡萄糖吸收的影响示于图7。

加入10μg/mlLBP3b到葡萄糖的系列浓度（从5到25mmol/l）作为实验组，以及相同浓度单葡萄糖溶液作为对照组，在实验组Caco-2细胞培养模型的BL侧的葡萄糖含量高于各对照组（P<0.05）。

比较实验组各组的吸收葡萄糖的时间，结果表明不同实验组之间的葡萄糖吸收量显着不同（P<0.05）。

这些结果表明LBP3b在不同浓度下都可以抑制葡萄糖吸收，实验组的葡萄糖浓度越小，LBP3b抑制葡萄糖吸收的效果越好。

与对照组比较，不同浓度的LBP3b溶液（20,10,5,2.5,1.25μg/ml）显着地抑制了某一浓度的葡萄糖（20mmol/l）的吸收（P<0.05）（图8）。

LBP3b的浓度越高，葡萄糖吸收量越少，因此对葡萄糖摄取具有更好地抑制作用（P<0.05）。

图6.LBP3b的1HNMR（A）和13CNMR（B）光谱。

将LBP3在室温下溶解于DMSO中，并在Brucker600NMR光谱仪上检查。

数值是d（ppm）。

图7.不同浓度的葡萄糖摄取受10μg/mlLBP3b影响。

Caco-2细胞用LBP3b（10μg/ml）和不同浓度的葡萄糖（5-25mmol/l）120分钟。

将10μg/mlLBP3b加入到葡萄糖的系列浓度（5-25mmol/l）作为实验组（分别为A，B，C，D，E），相同的单一葡萄糖溶液浓度作为对照组。

值为平均值±SD（n=5）。

*P<0.05，和相同的成分葡萄糖组相对比。

图8.不同浓度的LBP3b对某些特定浓度的葡萄糖的影响。

用葡萄糖（20mmol/l）和不同浓度的LBP3b（20-1.25g/ml）处理Caco-2细胞120分钟。

加入20mmol/l葡萄糖到LBP3b的系列浓度（20-1.25μg/ml的作为实验组（分别为A，B，C，D，E），20mmol/l葡萄糖作为对照组。

值是平均值±SD（n=5）。

*P<0.05，与对照组比较。

4.结论

在本研究中，来自L.barbarumL.的多糖是通过超滤膜分离的方法获得的，其具有低能耗、环保性、和对多糖的生理活性影响小的一些优点。

主要纯化级分LBP3b是通过各种分离柱从粗多糖中分离的杂多糖，所述分离柱由甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖和木糖以相对摩尔比为5.52：

5.11：

28.06：

1.00：

1.70组成，并且有时与蛋白质相连共价键。

UV，FT-IR，1HNMR和13CNMR谱中的几个典型峰证实了单糖组成。

低血糖效应的细胞实验证明了LBP3b抑制葡萄糖的摄取以及浓度依赖性对其的影响，这些表明葡萄糖吸收与LBP3b之间存在竞争抑制的作用。

可能这些结果的机制是LBP3b可能通过结合过葡萄糖吸收的位点，从而延迟葡萄糖的吸收，然后降低餐后血糖。

作为一个天然产物，LBP3b在高剂量下被证实是对Caco-2细胞是无毒的。

其价格低，分布广，无毒，无需吸收，减少餐后血糖等优良的特点为进一步发展健康食品和药物提供了良好的前景。

进一步的研究将通过代谢组学的方法筛选出LBP3b的潜在生物标志物，以进一步阐明机制低血糖活性。

这项研究得到中国科学基金（NSFCNo.81273069）国家自然资金;中央大学基础研究基金和研究生中国江苏省研究创新项目（No.KYLX0205）的资助。