特异性阻断SHH信号通路对外周血T细胞杀伤宫颈癌细胞功能的影响.docx

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特异性阻断SHH信号通路对外周血T细胞杀伤宫颈癌细胞功能的影响

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南方医科大学成人高等教育专升本毕业论文

论文题目：

特异性阻断SHH信号通路对外周血T细胞杀伤宫颈癌细胞功能的影响

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目录

摘要…………………………………………………………………………………...1

关键词………………………………………………………………………….……..1

第一章研究背景………………………………………………………….…………2

1.1实验材料及设备……………………………………………….………………….3

第二章研究方法及步骤

2.1Hela细胞的培养…………………………………………………………...……4

2.2RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分子的表达…………………….……5

2.3分离外周血单个核细胞（PBMC）……………………………………………6

2.4流式细胞技术检测T细胞活化相关CD分子………………………………….6

2.5ELISA检测T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-γ释放水平………………7

第三章研究结果

3.1RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分子的表达…………………….…….8

3.2PBMC对Hela细胞杀伤作用的形态学观察…………………………………..8

3.3流式细胞术检测T细胞活化相关CD分子………………………………..…..9

3.4ELISA检测T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-γ释放水平………………9

第四章

讨论……………………………………………………………………………………9

第五章

结论…………………………………………………………………………………..11

参考文献……………………………………………………………..………………11

摘要

目的：

研究SonicHedgehog分子及其活化信号对外周血T细胞杀伤宫颈癌细胞功能的影响。

方法：

RT-PCR检测Hela细胞SHH信号水平。

在Hela与PBMC共培养体系中添加SHH抗体来阻断SHH信号，形态学观察T细胞对Hela细胞的杀伤，流式细胞术检测T细胞活化，ELISA检测T细胞功能性细胞因子IFN-γ和IL-10释放水平。

结果：

SHH抗体可以促进T细胞分泌功能性细胞因子IFN-γ，但抑制免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌，增强T细胞杀伤宫颈癌细胞的效果。

结论：

特异性阻断SHH信号通路可以增强T细胞对宫颈癌细胞的杀伤作用。

【关键词】：

SHH；宫颈癌；T细胞

Abstract

Objective:

TostudytheSonicHedgehogsignalingmoleculeandactivationofTcellsinperipheralbloodofanti-cancercellfunction.Methods:

RT-PCRdetectionofHelacellsinSHHsignallevels.PBMCwereculturedintheHelasystemwithaddedSHHSHHantibodytoblockthesignal,Tcellsmorphologyofanti-Helacells,Tcellactivationbyflowcytometry,ELISAdetectionoffunctionalTcellcytokineIFN-γandIL-10releaselevel.Results:

SHHantibodiescanpromoteTcellsecretionofcytokinesIFN-γ,butthesuppressionoftheimmunesuppressivecytokineIL-10secretion,enhancedTcellkillingeffectsofcervicalcancercells.Conclusion:

ThespecificblockingSHHsignalingpathwaycanenhanceTcellkillingeffectoncervicalcancercells.

[Keywords]SonicHedgehog，cervicalcancer，Tcell

研究背景

肿瘤是一种常见的疾病，是机体在各种致瘤因素作用下，细胞异常增生而形成的新生物，肿瘤细胞具有异常的形态,代谢和功能。

由于它的快速而无规律生长，不但消耗人体大量营养，而且破坏了正常器官的组织结构和功能目前肿瘤已经成为一列严重威害人类身体健康的常见病和多发病，现在全世界每年死于癌症的约有500万人。

随着免疫学的发展和人们生活水平的提高，肿瘤越来越受到人们的重视，近来关于Hh信号通路与肿瘤发生的关系也引起注意，研究发现多种肿瘤中存在着Shh信号通路的异常激活，而宫颈癌细胞就是其中之一。

子宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。

在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌。

全球发病率最高的是南非，其次在亚洲，我国发病率每年新增发病数超过13万，占女性生殖系统恶性肿瘤发病率的73－93％，排行榜首。

在发达国家，其发生率明显下降，在很大程度上归因于对宫颈癌前病变的早期诊断和治疗。

在发展中国家，由于宫颈筛查工作不完善，女性对宫颈疾病的忽视，致使我国宫颈癌的发生率是发达国家的6倍。

Hedgehog（Hh）基因，因为最初是从突变的果蝇体内发现，果蝇胚胎腹侧面布满尖状突起形似刺猬因而将其命名为Hedgehogt[1]。

1993年Forbes[2]等通过果蝇基因分析，首先提出Hedgehog信号通路（Hedgehogsignalling，Hh信号通路）的概念，以后Chen等[3]较为系统地阐述了Hh信号通路的基本组成及转导过程。

在脊椎动物中，Hedgehog基因家族共包括三个成员：

Indianhedgehog（Ihh），Deserthedgehog（Dhh）和Sonichedgehog（Shh），其中关于Shh基因的研究最多。

因此Sonichedgehog信号通路（简称Shh信号通路）的研究也相对更为深入。

Shh信号通路对靶细胞的作用是通过细胞膜上Patched（PTC）和Smoothened（SMO）两个转录元件所介导。

PTC是一种12跨膜蛋白，可和SHH蛋白结合。

SMO是7跨膜蛋白为信号转导子。

当SHH蛋白和PTC蛋白结合时，则PTC对SMO抑制解除，通过胞质微管上附着的Hedgehog信号复合物（Hedgehogsignalingcomplex，HSC）介导，使一种转录因子进入胞核，从而激活其下游基因的表达，该转录因子在脊椎动物中称为GLI，即在果蝇中被称为的ci。

当SHH尚未与PTC结合时，PTC可以抑制SMO，使之转变成同一基因的转录抑制子，抑制其下游基因的表达。

GLI共有3型即GLI1、GLI2和GLI3，每一种都有独特的转录功能，引起不同下游靶基因的激活或抑制。

对果蝇的研究表明．不同浓度的Hh基因表达的分泌蛋白HH可以引起靶细胞中不同形式的Ci进入其细胞核，从而引起不同的下游基因的表达[4]。

脊椎动物的研究也表明，Shh信号通路对靶细胞命运的决定同样与SHH蛋白表达的强度密切相关．即不同浓度SHH表达可以引起其邻近靶细胞产生不同形式的GLI进入胞核，进而引起不同基因的表达[5]，参与维持肿瘤细胞的多种恶性生物学行为。

虽然机体的免疫系统能够产生肿瘤免疫应答，但是大多数肿瘤仍然能在体内进行生长，肿瘤细胞能通过自身的机制抑制免疫应答对自身的杀伤。

随着SonicHedgehog信号通路的异常激活在越来越多的肿瘤中发现，人们对这个信号通路产生了浓厚的兴趣。

现在人们不但发现SHH信号通路可以促进肿瘤细胞的增殖，而且人们还发现SHH信号通路也可以抑制T细胞的活化以及活化后的增殖，在已有国外实验发现了SHH分子及其活化信号在参与抑制T细胞活化和发育方面具有一定的作用，这可能是肿瘤自我保护，逃逸体内免疫应答的重要机制之一。

本研究通过阻断SHH信号后研究T细胞的活化及功能，探讨SHH信号对T细胞杀伤宫颈癌细胞株Hela的影响，为子宫癌防治提供新的思路，有助于提高子宫颈癌治疗的效果，并推动肿瘤免疫的理论发展。

1.1实验材料及设备：

1.1.1细胞

1.1.1.1肿瘤细胞

1.1.1.2PBMC细胞

1.1.2主要化学试剂：

胰蛋白酶粉末广州威佳科技有限公司

RPMI-1640干粉（10.4g/包）Sigma公司

碳酸氢钠广州化学试剂厂

胎牛血清杭州四季青生物工程公司

氯化钠台山化工厂

氯化钾广州化学试剂厂

磷酸氢二钠广东汕头达濠精细化学品公司

磷酸二氢钾汕头市化学试剂厂

SHH抗体SantaCruz

ELISA试剂盒达科为生物技术有限公司

1.1.3主要仪器设备：

单人双面净化工作台SW-CJ-1F型苏州净化单人双面净化工作台

离心机上海安亭科学仪器厂TDL-5Max:

5000rpm

4℃冰箱Haier公司BCD-256KF

超纯水仪PallCorporation公司Model：

CascadaLS

Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统上海天能科技有限公司

202A-2型数显电热恒温干燥箱上海浦东荣丰科学仪器有限公司

SCIENTZSB5200D超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司

二氧化碳细胞培养箱Heraeus公司HERAcell150

手提式压力蒸汽灭菌器YX-280合肥华泰医疗设备有限公司

流式细胞仪美国BeckmanCoulter公司

倒置荧光显微镜奥林巴斯

BP110S电子天平Sartorius公司Max:

110gd＝0.1g

JYT-2架盘药物天平马头牌

微量移液器PipetmanGilson公司

2研究方法及步骤

2.1Hela细胞的培养

2.1.1细胞培养用具的准备

1）浸泡：

将细胞培养瓶、移液管、10、50ml离心管、试剂瓶、血清瓶、安培瓶等实验用具用清水冲洗干净，浸泡于洗衣粉水中，浸泡过夜。

2）刷洗：

用试管刷沾洗衣粉反复刷洗，反复冲洗干净后放入电热恒温干燥箱中烘干。

3）浸酸：

将烘干的器皿放入酸缸中浸泡过夜，玻璃用具浸泡于硫酸缸中（配方：

重洛酸钾63g，浓硫酸1000ml，蒸馏水200ml），塑料用具浸泡于盐酸缸中（5％盐酸）。

4）冲洗：

用具浸酸后用清水冲洗15次以上，再用单蒸水冲洗3次，再用双蒸水冲洗3次，必要时放入超声波清洗机中清洗，再放入电热恒温干燥箱中烘干。

5）高压：

将烘干的实验用具用锡纸包好，再用报纸包好，大、中、小枪头直接用枪头盒装好用报纸包好，置高温高压灭菌箱中高压灭菌，再放入电热恒温干燥箱中烘干。

2.1.2细胞复苏（Hela细胞）

从-120℃液氮罐中取出冻存的Hela细胞，迅速放到37℃水浴锅中，使细胞溶解，用酒精灯轻烧冻存管口，打开管盖，用吸管吹散细胞后，吸出细胞悬液到离心管中，加入2～3ml1640培养液，混匀后离心1000rpm，10min；弃去上清液，加入5ml新鲜培养液（含10％血清），并用吸管轻轻吹打悬浮细胞，将细胞悬液移到细胞培养瓶中，37℃培养。

2.1.3细胞传代

取生长良好的Hela细胞，在超净台中倒去旧培养液，加入2mlPBS，轻轻振荡漂洗细胞，以去除细胞碎片，弃去PBS，再加入胰酶溶液，37℃消化大约2min，在倒置显微镜下观察细胞情况，待细胞开始变圆球形时，立即停止消化，并弃去胰酶，加入2ml1640培养液，加入一滴血清，然后反复吹打细胞，使Hela细胞悬浮，再取1ml细胞悬液移到另外一个干净的培养瓶里，最后每瓶细胞的培养基补到5ml（含10％牛血清），做好标记，放进细胞培养箱里培养。

2.1.4细胞换液

取生长良好的Hela细胞，在超净台中倒去旧培养液，加入2mlPBS，轻轻振荡漂洗细胞，以去除细胞碎片,弃去PBS,加入5ml（含10％牛血清）的1640培养基，放进细胞培养箱里培养。

2.1.5细胞冻存

在超净台中倒去旧培养液，加入2mlPBS，轻轻振荡漂洗细胞，以去除细胞碎片,弃去PBS，再加入胰酶溶液，37℃消化大约2min，在倒置显微镜下观察细胞情况，待细胞开始变圆球形时，立即停止消化，并弃去胰酶，加入2ml1640培养液，加入一滴血清，然后反复吹打细胞，让细胞从瓶壁上吹打下来，使Hela细胞悬浮，再将细胞悬液转移到离心管中，1000rpm，10min，弃去上清液，加入1ml1640培养基，300ul血清，150ulDMSO，将细胞重悬，将悬液转移到冻存管，遵从“慢冻”原则，先在4℃保存2小时，再移到-20℃保存4小时，再移到-80℃保存24小时（过夜），最后移进液氮罐。

2.2RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分子的表达

2.2.1提取Hela细胞的RNA

Trizol抽提步骤：

1）匀浆化作用

通过离心来沉淀细胞后，弃上清，用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞

至均一通亮的液态后，将匀浆样品在15—30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体

完全分解。

2）分离阶段

每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿。

盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管。

在4°C下12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。

离心后混合物分成三层：

下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。

RNA无一例外地存在于水样层当中。

3）RNA的沉淀

将水样层转移到处理过的EP管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。

最初

均化时的每1mlTRIZOL对应0.5ml异丙醇。

在4°C下12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。

RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4）RNA的洗脱

移去上层悬液。

用异丙醇洗涤RNA沉淀一次，在4°C下7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。

5）RNA的再溶解

在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。

尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那

样会极大地降低它的可溶性。

部分溶解的RNA样品其A260/280比值<1.6。

用移高压过的水20ul溶解RNA。

6）等DNA电泳条带跑到将近电泳板中间即可上机扫描。

2.2.2琼脂糖凝胶电泳

1）称取0.3g琼脂糖，加入20ml1×TAE缓冲液（小胶，浓度：

1.5％），混匀于三角瓶中，将三角瓶放入微波炉加热（注意瓶口盖住，防止凝胶因蒸发而减少）。

2）待凝胶溶液稍微冷却，加入1.2μlEB，混匀后倒入事先用电泳缓冲液浸泡的电泳板中（梳子先插好）。

3）等凝胶凝固后，水平垂直拔梳，将凝胶放入电泳槽中。

4）将1μl样品与1μl6×laodingBuffer与4μlH20混匀，上样，Marker为2000bp。

5）设置恒压100MV，开始电泳。

2.3分离外周血单个核细胞（PBMC）

将成分血与PBS按1：

5的比例稀释，将稀释后的成分血沿着管壁缓慢加在占血液量1/2的淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心2000rpm，15min。

此时离心管中自上而下形成4层，用滴管小心抽取由PBMC构成的云雾层（由上到下第二层），转移到新的离心管，再离心1500rpm，10－15min。

去掉上清液，如发现有红细胞可以加入红细胞裂解液5－10ml，用滴管轻轻吹散，静置10min。

再次离心1500rpm，10min。

去掉上清液，加15mlPBS吹打，离心1500rpm，10min。

去掉上清液后再加5mlPBS吹打，离心1500rpm，10min。

最后弃上清液，加入2ml培养基，重悬细胞，再将细胞重悬液转入新的培养瓶，补加到5ml培养基（包括血清），加入2.5ul/mlIL-2。

将其放入细胞培养箱培养。

2.4流式细胞术检测T细胞活化相关CD分子

2.4.1种板（6孔板）

1）取生长状况良好的两瓶Hela细胞，弃去原培养液，各加入2mlPBS清洗细胞，再弃去PBS。

2）各加入1ml胰酶消化细胞2min，弃去胰酶。

3）各加入2ml培养基，用滴管将瓶壁的细胞吹打下来。

4）将两瓶培养瓶的细胞悬液转移到同一离心管中，吹打均匀。

5）另取一EP管，加入180ulPBS。

6）取20ul细胞悬液加入到上述EP管中，吹打均匀。

在细胞计数板上进行细胞计数。

7）取上述细胞悬液加入6孔板中，然后每孔各补加血清10％，培养基，吹打均匀，使每孔都为2ml，每孔有3×105个Hela细胞，将6孔板放入细胞培养箱培养。

2.4.2共培养

1）将六孔板分为3组，分18hr24hr48hr三个不同时间段检测：

实验组：

SHH高表达子宫癌细胞（株）+外周血T细胞+SHH抗体；

对照组：

SHH高表达子宫癌细胞（株）+外周血T细胞

2）先取20ulPBMC细胞悬液加入装有180ulPBS得EP管中，吹打均匀。

在细胞计数板上进行细胞计数。

3）将6孔板中的培养液用移液枪吸出。

在3个孔中加入原PBMC悬液，血清10％，培养基，使每孔都为2ml，每孔有3×106个PBMC细胞，而其他3个孔中更新新的血清10％，培养基，将6孔板放入细胞培养箱里培养，其中在实验组里面每孔加入SHH抗体10ul，使孔中SHH抗体终浓度是1μg/mL。

2.4.3流式细胞术检测

1）取12个EP管，与6孔板上的孔一一对应，编上号。

2）用移液枪将6孔板内的液体吹打均匀，注意要把所有细胞都基本吹打下来，然后转移到相应的EP管中，离心3000rpm×3min，弃掉上清液。

3）用1mlPBS洗涤细胞一次，离心3000rpm×3min，弃掉上清液。

4）每支EP管各加入60ul的PBS，吹打均匀。

5）与18hr时间段的孔对应的EP管每管都加入10ulCD3单抗和10ulCD69单抗进行标记。

6）与24hr48hr时间段的孔对应的EP管每管都加入10ulCD3单抗和10ulCD45RO单抗进行标记。

7）另取4个EP管分别加入1mlPBMC细胞悬液，离心3000rpm×3min，弃去上清液，再用1mlPBS洗涤细胞一次，分别编号空白，CD3单抗,CD69单抗，CD45RO单抗。

再分别用对应的CD分子标记。

8）将所有EP管用锡纸包好后，避光作用25min。

9）另准备16支流式管，与EP管一一对应编上号，再用锡纸包好后置于试管架上。

10）染色结束后，用移液枪将EP管中的液体全部转移到相应的流式管中。

11）每支流式管各加入2ml流式洗涤液，离心1000rpm×10min。

12）弃掉上清液，加入500ul85％的多聚甲醛打散细胞

13）上机检测

2.5ELISA检测T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-γ释放水平

2.5.1种板（96孔板）

1）取生长状况良好的两瓶Hela细胞，弃去原培养液，各加入2mlPBS清洗细胞，弃去PBS。

2）各加入1ml胰酶消化细胞2min，弃去胰酶。

3）各加入2ml培养基，用滴管将瓶壁的细胞吹打下来。

4）将两瓶培养瓶的细胞悬液转移到同一离心管中，吹打均匀。

5）另取一EP管，加入180ulPBS。

6）取20ul细胞悬液加入到上述EP管中，吹打均匀。

在细胞计数板上进行细胞计数。

7）取上述细胞悬液，补加血清10％，培养基，吹打均匀，使每孔都为200ul，每孔有6×104个PBMC细胞,将新配好的细胞悬液加入96孔板，再将96孔板放入细胞培养箱培养。

2.5.2共培养

1）将96孔板分为5组，分别为：

实验组：

SHH高表达子宫癌细胞（株）+外周血T细胞+SHH抗体

对照组：

SHH高表达子宫癌细胞（株）+外周血T细胞

SHH高表达子宫癌细胞（株）

外周血T细胞

培养基+10%血清

2）先取20ulPBMC细胞悬液加入装有180ulPBS得EP管中，吹打均匀。

在细胞计数板上进行细胞计数。

然后用培养基，血清与原PBMC细胞悬液配到每个孔为6×104个PBMC，每孔为为200ul的体积。

3）在之前种肿瘤细胞的96孔板，用移液枪将培养基吸出。

在其中实验组加入新配好的PBMC悬液，而其他对照组更换新的培养基和血清，将其放入细胞培养箱里培养。

其中在实验组里面加入SHH抗体1ul，使孔中SHH抗体终浓度是1μg/mL。

2.5.3ELISA检测

1）使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。

2）收集96孔板孔里的细胞上清液，100ul/well加入标准样品孔里。

3）加检测抗体：

50ul/well加入稀释的Biotinylatedantibody混匀后盖上封板膜，室温（18－25C）孵育2hr。

4）洗板：

扣去孔内液体，290ul/well加入1×washingbuffer；停留1min后弃去孔内液体，重复3次，最后一次在滤纸上扣干。

5）加酶：

100ul/well加入Streptavidin－HRP。

盖上封板膜。

室温孵育20min

6）洗板：

扣去孔内液体，290ul/well加入1×washingbuffer；停留1min后弃去孔内液体，重复3次，最后一次在滤纸上扣干。

7）显色：

100ul/well加入TMB。

室温避光孵育10－15min。

8）终止反应:

迅速100ul/well加入StopSolution终止反应。

9）读板：

终止后10分钟内，用酶表仪检测，检测波长为450nm。

3研究结果

3.1RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分子的表达

图1.Hela细胞SHH关键分子表达

Fig1.HelacellexpressionofkeymoleculesSHH

M：

Marker（DL2000）;1:

GAPDH（657bp）;2:

GLI-1（185bp）；3:

GLI-2（322bp）;

4：

Fas（320bp）；

表1Hela细胞SHHSHH关键分子表达水平

基因光密度比

GLI-1/GAPDH0.708229

GLI-2/GAPDH0.458853

FAS/GAPDH0.564422

由图1我们可以知道Hela细胞表达SHH关键分子GLI-1,GLI-2基因，推测HELA细胞SHH信号通路是处于激活状态的。

3.2PBMC对Hela细胞杀伤作用的形态学观察

倒置显微镜下观察T细胞杀伤肿瘤细胞情况，结果显示：

Hela细胞和PBMC共培养24hr，没加SHH抗体的共培养体系中Hela细胞的生长状况良好，而加了SHH抗体的共培养体系中Hela细胞生长较差，部分Hela细胞形态有变圆趋势，细胞通透性较差；共培养48hr，没加SHH抗体的共培养体系中Hela细胞生长状况已经出现死亡，而加了SHH抗体的共培养体系中Hela细胞死亡更严重，外周血T细胞数量也明显较多；共培养72hr，没加SHH抗体的共培养体系中仍有形态较好的Hela细胞，而加了SHH抗体的共培养体系中基本已经没有形态较好的Hela细胞了，细胞膜已经不完整，死亡细胞与细胞碎片聚集成团，并呈漂浮状。

3.3流式细胞术检测T细胞活化相关CD分子

本研究还采用流式细胞术检