膜片钳常见问题解答讲解.docx
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膜片钳常见问题解答讲解
膜片钳常见问题解答
（一）
1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？
答：
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。
由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。
膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。
从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。
随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。
2.离子通道电导的单位是什么？
如何换算？
答：
离子通道电导的单位是西门子（Siemens,S），旧称姆欧，即安培/伏特。
常用皮西门子（pS），1pS＝10E-12S， 1,000pS＝1pA/mV。
3.MultiClamp700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的rawoutput是否需要连接信号器的ANALOGIN接口?
scaledoutput，rawoutput有什么区别?
答：
Rawoutput为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等），scaledoutput为定标输出，输出的信号经过了处理。
后者的灵活度大，因此多采用。
目前膜片钳放大器多设有scaledoutput，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOGIN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Rawoutput了。
若你想记录两个输出，则需要将Rawoutput与数模转换器的另一个ANALOGIN连接。
4.在Clampex的Editprotocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用范围？
答：
Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。
而像钠通道，其衰减非常迅速，在持续去极化的情况下，通道很快失活，无法使用ramp，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用ramp。
5.什么是ramp？
有什么作用？
答：
与步阶（step）不同，ramp在pClamp软件中表示施加给细胞的一种逐渐变化的电压或电流，称为“斜坡电压或电流”，可用于作通道I-V曲线。
膜片钳常见问题解答
（二）
6.inputresistance是什么意思？
如何测量？
答：
在电生理学中，“inputresistance”指“输入膜电阻（Rin）”。
全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（一般为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出Rin。
膜电阻（Rm）与膜输入阻抗Rin的关系为：
Rm＝4πr2Rin，r为细胞半径。
7.在一次电压钳全细胞记录中，是否每次一定要做电容消除、串连电阻补偿、漏减、和液接电位矫正？
答：
在电压钳实验中，如果需要给予细胞电刺激来改变细胞膜电位（如超极化或去极化），则会出现膜的被动反应，产生电容电流与电阻电流，此时，前者需要用电容补偿消除，后者需要用漏减功能消除。
全细胞记录中，串联电阻是必须要补偿的（至少要补偿80%），除非它很小而忽略不计。
液接电位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。
你可采用Clampex软件中的菜单Tools/JunctionPotential功能对其测算，然后决定是否需要校正。
8.Decay是什么意思？
和inactivation有何区别?
答：
Decay是“衰减”之意，inactivation是“失活”之意，但在文献中经常混用，decay也常常被说成失活，例如钙电流的衰减常被说成失活，这样用也没什么问题。
但实际上，两者细分的话还是有区别的。
可以将Inactivation分为稳态失活与非稳态失活。
后者即Decay，是指在刺激因素（电位变化、施加药物等）持续存在下通道的失活，而稳态失活（Steady-stateinactivation）一般是指将膜电位钳制在不同的水平，然后观察通道的失活情况，做出失活曲线。
9.什么是尾电流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？
答：
在离子通道的激活因素（去极化或超级化）结束时通道的关闭过程叫做去激活（Deactivation），所记录到的电流称为尾电流（Tailcurrent），主要反映通道的关闭特征。
延迟整流性K+离子通道以及一些不同类型的Ca2+离子通道，它们的尾电流均具有电压依赖性，关闭过程呈指数分布，可用指数方程拟合而获得通道关闭过程的时间常数。
尾电流的分析对研究电压门控性离子通道的激活、关闭、失活等动力学过程很有帮助。
如研究尾电流幅度与脉冲电压的关系、脉冲电压的不同持续时间或尾电流不同的钳制电压对尾电流幅度、衰减时间常数的影响等等。
通过这些研究可了解通道关闭过程中出现的不同关闭状态。
药物可影响通道的关闭过程，表现为尾电流的衰减过程变快或变缓慢。
10.如何理解steadystateactivation中的steadystate的意义？
答：
“steadystate”是“稳态”的意思。
一般通过给予细胞持续一定时间的一系列去极化（多为去极化）脉冲来激活离子通道，记录通道电流峰值，再计算岀电导G，作出G-V曲线，该曲线称为稳态激活曲线，也就是我们常说的激活曲线。
膜片钳常见问题解答（三）
11.电极拉制程序中具体应该如何控制。
在参数设定的摸索中，是否需要每次都用显微镜检测，还是另有更易操作的方法.
答：
不同的拉制仪拉制参数的设置不尽相同，你需要阅读说明书，参数中主要是设定拉力（对于P-97拉制仪，只需要设置Velocity，可不用设定Pull）与温度。
一般第一步拉制电极颈部，温度要比第二步高（对于P-97拉制仪，温度的设定需要先测量Ramp值），拉力不要过大，以保证颈部较短；第二步拉制尖端，一般要使温度低些，拉力大些。
一般都是通过显微镜查看电极尖端，这很简单，并不复杂！
最好是抛光，这样就在抛光仪显微镜下查看。
注意抛光后的电极尖端开口会变小，故在拉制电极时，尖端开口要大些。
检查电极还有其它方法，如“气泡数法”，也可用放大器通过测量电阻来查看。
12.Rm＝4πr2Rin？
似乎Rin是一个用细胞大小标化的膜电阻，那为什么不用电容Cm来标化而用这个什么4πr2？
细胞形状各异，Cm是个公认的膜面积的指标，电流密度不就是用Cm标化的吗？
盼回答，同时希望能将Rin的意义再多讲一点，谢谢
答：
（1）一定要注意不要拘泥于Rm和Rin这两个符号，文献中常混用，但实际上表示的大多是Rin。
通常我们所说的“膜电阻”是指“膜输入阻抗Rin”，但也有人用来指Rm。
（2）你可以用Cm来计算膜面积，实际上这也正是我们的做法，用来估算细胞大小，用于对通道电流幅度进行标化，但我们从来不用它计算膜电阻Rm（也称为“固有膜电阻”）。
Rm的计算公式是数学理论上的，并没有多少应用的价值，我们很少发现有使用Rm的（虽然符号用Rm）。
（3）实际上，Rin反映的当然就是膜电阻，它被称为膜输入阻抗（或膜输入电阻），也时常被称为“膜电阻”（这正是使人们产生混淆的原因！
），是膜的被动反应参数之一。
所谓被动反应是指膜上离子通道没有开放时，膜所表现出的电缆特性。
膜的被动反应参数还包括膜电容、轴浆电阻等。
全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（多为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律可求出Rin。
当大量离子通道开放时，膜对电流的阻力急剧降低，测试脉冲电压与通道电流之间不满足欧姆定律，无法测量Rin，也没有了测量的意义。
13.请教什么是Channelavailability？
答：
Channelavailability指在排除失活情况下，能够开放的某通道的多少，通过全细胞电流幅度的大小来反映。
例如，海马神经元Na通道的channelavailability可因乙酰胆碱M受体的激活而降低，表现为Na通道电流幅度的降低。
14.什么是windowcurrent，我知道是激活曲线和失活曲线的重叠。
但是我有一个疑问，比如电压依赖的T型钙通道，书上说在windonwcurrent的时候有持续性的钙内流，但是T性钙通道不是有时间依赖性的失活吗？
怎么会有不失活的电流呢？
答：
如果将通道的稳态激活曲线与失活曲线作在一个图上，则激活曲线与失活曲线之间交叉部分的电流就是windowcurrent，在这个电压范围内，有一些通道并没有完全失活，仍能被打开，有一定的开放概率。
T性钙通道是有时间依赖性的失活，但还有很小的部分失活非常缓慢，此即windowcurrent，它是一些快速失活通道的动力学特征。
对于T型钙通道，其windowcurrent维持了一个紧张性去极化，对动作电位的连续发放产生影响，当然，不同细胞中的T通道其作用不尽相同。
15.使用Clampex8.0记录配体门控离子通道电流，protocol如何设置?
答：
需要事先在LabBench中设定好Channel序号和Signal名称。
在EditProtocol中选择Gap-free模式，采样频率可用5kHz，选好Input和Output。
先在Clampex中启动记录（Record），然后诱发电流，可用TimeTag作诱发标记。
膜片钳常见问题解答（四）
16.电极内液中加入1mmol/L的EGTA和10mmol/L的EGTA有什么区别?
答：
EGTA一般用10mM左右（1mM太低），促进封接，鳌和内钙。
17.什么是漏电流，为什么要做Leaksubtraction？
答：
漏电流的概念比较混乱，可以指封接电流（封接时从封接处“漏掉”的电流），也可指放大器的系统偏差，还可指膜漏电流。
一般来讲，膜漏电流是细胞膜的被动反应电流，是非离子通道电流，因此在记录离子通道电流时要将它去除。
膜片钳放大器与采样分析软件都具有将其去除的漏减功能。
18.请问动作电位是否一定要有越过0的超射，我在一篇文献中看到作者将一个没有超射的电位变化也称为动作电位，我觉得不对，应该是阈下反应才对吧？
但又不敢下结论，觉得国外文献不该出错。
答：
一般生理情况下动作电位都含有超射，超射与Na离子（或Ca离子）的平衡电位有关。
但在具体实验中（或某些病理情况下），若细胞内外液的Na离子（或Ca离子）的浓度发生变化，则Na离子（或Ca离子）的平衡电位也随之变化，就可能不产生超射或超射值更大。
19.我想请教一下为什么我们用培养的大鼠海马神经元记录NMDA电流，总是会出现电流的衰减，而且我们记录是选择的培养第10-14天的大鼠，可是电流大小不等，具体在100-1500pA间波动，这让我们很疑惑，注明一下，电极内液中我们用了CsCl和ATP、GTP。
答：
电流大小不等与细胞大小、细胞状态等都有关，另外更重要的可能与你的给药方法有关，不知你采用的是哪种给药方法？
正常情况下，连续诱发受体电流会存在失敏，表现为电流的衰减（幅度减小），但如果在记录过程中细胞状态逐渐不好，也会出现这种情况。
我们认为你所选用的细胞培龄没有问题，内液也没问题。
20.脑片实验中，ACSF的配方中的Mg离子，有的用的MgSO4，有的用的MgCl2，他们有什么区别？
有关渗透压，有的配方是295mOsm，有的300多mOsm，他们又有什么区别？
如何调整ACSF的渗透压？
答：
用MgSO4和用MgCl2没多大区别，但如果要记录Cl电流，就要有所考虑；另外若所需要的Mg浓度有大的变化，也要考虑到Cl和SO4离子所可能带来的问题。
渗透压有个范围，一般在290－320之间都没有问题，精确地测量与调节渗透压需要特殊的渗透压仪，但一般都是通过离子强度进行计算，只要大体在上述范围就行。
膜片钳技术在神经药理方面的应用
（1）
1976年Neher和Sakmann建立了膜片钳技术（Patchclamptechnique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。
1981年Hamill,Neher等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。
该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年诺贝尔医学与生理学奖。
一膜片钳技术的基本原理
用一个尖端直径在1.5~3.0μm的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。
基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。
膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。
膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。
膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。
膜片钳技术在神经药理方面的应用
（2）
二操作步骤
１．膜片钳微电极制作
（1）玻璃毛细管的选择：
有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。
软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。
玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在1.1~1.2mm。
内径1mm。
（2）电极的拉制：
分二步拉制。
第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。
调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。
电极必须保持干净，应现用现拉制。
（3）涂硅酮树酯：
记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导电性的特性。
涂完硅酮树酯的玻璃微电极须通过加热的镍铬电阻线圈烘干变固，以防硅酮树酯顺着电极流向尖端而影响千兆封接。
烘干后才能进行热磨光。
（4）热磨光（heatpolish）：
一般在玻璃研磨器下对电极尖端进行热磨光，磨光后可使电极尖平滑并烧去过多的硅酮树酯薄膜，有利于千兆封接的形成。
目前大多数实验室在作全细胞模式记录时，不涂硅酮树酯也不进行热磨光，也可形成很好的千兆封接。
（5）电极液的充灌：
目前最常应用的是用注射器反向充灌。
用细长的注射器针头或拉细的聚乙烯胶管从电极尾端插入到电极尖端，再进行灌注。
灌注后电极尖端有少许气泡，排除气泡的方法是用左手拿住电极，尖端向下，用右手轻轻弹击电极，可见气泡徐徐上升直至排除。
电极液不要充灌太满，能与探头的银丝接触上即可，溶液过多会浸入探头支持架致使潮湿而影响实验记录。
膜片钳技术在神经药理方面的应用（3）
２．溶液的组成
（1）电极液：
根据记录的电流不同电极液的成分也不同。
基本要求是等张的KCI溶液，Ca2+浓度为10~100nmol（pCa7~8），pH值7~7.4。
这里介绍一个在全细胞记录模式时，通过改变保持电位，能分别记录到Na+、K+、Ca2+电流的电极液成分（mmol/L）：
KAspartic49.89，KCI30.37，KH2PO425，HEPES20.12，EGTA0.999，KOH29.95，MgCI21，CaCI20.2，ATPNa26.8。
用KOH调pH至7.4。
如果要记录纯的Na+、K+、Ca2+电流，则需要使用相应的工具药。
HEPES（N-2-hydroxyethyopiperazine-N’-2-ethanesulfonicacid，羟乙基哌嗪乙烷磺酸）
（2）细胞外液（浴槽液）：
分离细胞和记录电流时应用。
分离神经细胞主要用人工脑脊液（artificialcerebrospinalfluidsolution，ACSF），成分（mmol/L）：
NaCI124，KCI2.5，NaH2PO41.25，MgSO42.0，CaCI22，NaHCO326，glucose10。
该液体需要通以95%O2＋5%CO2混合气体。
如果用HEPES作缓冲系，则ACSF的成分如下（mmol/L）：
NaCI140，KCI2.5，MgCI21，CaCI21，glucose25，HEPES10。
上述溶液的配制均使用去离子水。
膜片钳技术在神经药理方面的应用（4）
３．神经细胞的分离
运用膜片钳技术进行电生理学研究需要制备合适的单个细胞作标本，细胞制备的好坏直接影响实验的成功率。
膜片钳实验要求细胞标本具有呼吸活性、耐钙、细胞膜完整、平滑、清洁度高的条件，以利于微电极与细胞膜进行高阻封接。
活性好的细胞在形成全细胞模式后可以保持活性很长时间，足以保证实验的顺利进行。
因此制备好的细胞标本是膜片钳实验的关键第一步。
七十年代以来，出现了许多分离各类细胞的分离技术，但是进行电生理学研究尤其是膜片钳实验多应用酶解分离细胞的方法。
我们实验室曾分离过豚鼠心室肌细胞、大鼠肝脏细胞、大鼠脑皮层神经细胞、家兔肺动脉平滑肌细胞和人脑皮层神经细胞及人心房肌细胞。
这里重点介绍大鼠脑皮层神经细胞的分离技术。
（1）用30mg/kg戊巴比妥钠ip麻醉后，断头开颅取出大脑半球放入冷的人工脑脊液中，轻轻剥离脑膜和血管等纤维组织，然后取脑皮层在人工脑脊液中剪成2mm×2mm的组织块静止１小时，并通以氧气。
（2）将脑组织块放入含有protease16unit/ml（typeⅩ,sigma）和protease2unit/ml（typeⅩⅣ,sigma）的人工脑脊液中，在36℃恒温震荡（60次/min）水浴中孵育60分钟左右。
（3）将组织块取出，反复用人工脑脊液冲洗５次，以彻底清除消化酶，于室温下静止60分钟并继续通氧，实验前将组织块轻柔吹打后即可分离出单一的神经细胞供实验使用。
膜片钳技术在神经药理方面的应用（5）
４．千兆欧姆封接
取一滴细胞液，滴入浴槽中，用人工脑脊液进行灌流，将浮游的死细胞冲走，待细胞贴壁后即可进行封接吸引。
通过PCLAMP软件或电子刺激器，给予一个20mV，10~50ms的矩形波刺激，当电极进入浴槽溶液时，记录电流的直线变成与矩形波电压脉冲相对应的矩形波曲线，将电极尖轻轻压在细胞膜表面，此时电流曲线的高度变低，给电极以负压吸引，由于电极尖与细胞膜逐渐密接，细胞膜与电极间的电阻逐渐增加，电流曲线逐渐减小
直至变成一条直线，则形成了千兆欧姆封接。
膜片钳技术在神经药理方面的应用（6）
5．记录模式
根据研究目的选择记录模式，主要有下面叙述的前４种，后３种是依据前４种变更而来的。
（1）细胞贴附式（cell-attached或on-cellmode）：
千兆欧姆封接后的状态即为细胞贴附式模式，是在细胞内成分保持不变的情况下研究离子通道的活动，进行单通道电流记录。
即使改变细胞外液对电极膜片也没有影响。
（2）膜内面向外式（inside-outmode）：
在细胞贴附式状态下将电极向上提，电极尖端的膜片被撕下与细胞分离，形成细胞膜内面向外模式。
此时膜片内面直接接触浴槽液，灌流液成分的改变则相当于细胞内液的改变。
可进行单通道电流记录。
此模式下细胞质容易渗漏（washout），影响通道电流的变化，如Ca2+通道的run-down现象。
（3）全细胞式（whole-cellmode）记录：
在细胞贴附式状态下增加负压吸引或者给予电压脉冲刺激（zapping），使电极尖端膜片在管口内破裂，即形成全细胞记录模式。
此时电极内液与细胞内液相通成为和细胞内电极记录同样的状态，不仅能记录一个整体细胞产生的电活动，并且通过电极进行膜电位固定，也可记录到全细胞膜离子电流。
这种方式可研究直径小于20μm以下的小细胞的电活动；也可在电流钳制（currentclamp）下测定细胞内电位。
目前将这种方法形成的全细胞式记录称作常规全细胞模式（conventionalwhole-cell
mode或holecellmode）。
（4）膜外面向外式（outside-outmode）：
在全细胞模式状态下将电极向上提，使电极尖端的膜片与细胞分离后又粘合在一起，此时膜内面对电极内液，膜外接触的是灌流液。
可在改变细胞外液的情况下记录单通道电流。
（5）开放细胞贴附膜内面向外式（opencell-attachedinside-outmode）：
在细胞贴附式状态下，用机械方法将电极膜片以外的细胞膜破坏，从这个破坏孔调控细胞内液并在细胞贴附式状态下进行单通道电流记录。
用这种方法时，细胞越大，破坏孔越小，距电极膜片越远，细胞因子的流出越慢。
穿孔膜片式（perforatedpatchmode）或缓慢全细胞式（slowwhole-cellmode）：
在全细胞式记录时由于电极液与细胞内液相通，胞内可动小分子能从细胞内渗漏到电极液中。
为克服此缺点，可在膜片电极内注入制霉菌素（nystatin）或二性霉素Ｂ（amphotericin 使电极膜片形成多数导电性小孔，进行全细胞膜电流记录，故被称为穿孔膜片式或制霉菌素膜片式（nystatin-patchmode）。
又因胞质渗漏极慢，局部串联阻抗较常规全细胞记录模式高，钳制速度慢，故也称为缓慢全细胞式。
（7）穿孔囊泡膜外面向外式（perforatedvesicleoutside-outmode）：
在穿孔膜片式基础上，将电极向上提，使电极尖端的膜片与细胞分离后又粘合在一起形成一个膜囊泡。
如果条件很好，在囊泡内可保留细胞质和线粒体等，能在比较接近正常的细胞内信号转导和代谢的条件下进行单通道记录。
6.细胞内灌流方法：
细胞内灌流是在全细胞式状态下利用电极内灌流法形成的。
电极内灌流法的装置是由电极固定部、灌流液槽、注入管、流出管、电极记录用琼脂桥所组成。
注入管是用直径2.5mm的塑料管经加热拉细制成，使其尖端能插到接近电极的尖顶部。
灌流液槽注满实验用溶液，插入注入管，当千兆封接形成后，由于负压吸引的作用电极内液从流出管流入排液槽的同时，实验用溶液由流入管注入到电极内，电极充满实验用溶液
后关闭注入管，完成了液体的交换。
这种方法应用在“内面向外式”时，可同时改变细胞内液和细胞外液的组成；应用在“全细胞式”时就形成了细胞内灌流方法，直接改变了细胞内液。
膜片钳技术在神经药理方面的应用（7）
7.全细胞记录模式离子通道电流记录
（1）钠通道电流（INa）：
灌流液即细胞外液同人工脑脊液液，也可加入CoCl23mmol/L或nifidipine10μmol/L以阻断钙电流。
电极液成分（mmol/L）：
CsCl150,EGTA11,CaCl21,MgCl21,HEPES10,用CsOH调pH至7.4。
电压钳制方案，通常设保持电位（holdingpotential）为-80mV，去极化电压为-10~+40mV，步阶电压10mV，去极化的保持时间（刺激脉冲宽度或钳制时间）10~40ms。
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