饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响.docx
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饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响
饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响
摘要：
以植物乳杆菌和大肠杆菌E.colik88为指示菌株，研究了饲料的液态转固态发酵与固态发酵两种工艺在20℃与30℃两种温度下的pH值变化及菌数的动态变化。
结果表明：
①30℃温度下，物料的酸度变化（pH值）比20℃温度时下降的速度快、幅度大；②在固态发酵过程中，液态转固态发酵的起始pH值低于固态发酵（P＜0.05），但液态转固态发酵和固态发酵在发酵过程中pH值差异不显著（P＞0.05）；③在30℃的发酵温度下，乳酸细菌数呈先增值后下降趋势，但液态转固态发酵与固态发酵之间差异不显著（P＞0.05）；④在液态转固态发酵工艺下，大肠杆菌E.colik88菌数呈直线下降趋势，而在固态发酵工艺下，大肠杆菌E.colik88菌数呈先升后降，证实液态转固态工艺对原料中大肠杆菌直接产生抑菌作用。
关键词：
益生菌；发酵工艺；乳酸菌数；抑菌特性
随着饲料中抗生素类生长促进剂在欧盟的全面
禁用，饲料微生物发酵技术在动物生产中受到高度重
视，欧盟已实现广泛应用。
饲喂微生物发酵饲料有提
高动物生长性能和改善肠道健康的作用（Scholten等，
1999；Canibe等2007），荷兰至少有50％的猪在饲喂
发酵饲料，丹麦有30％以上的母猪饲喂发酵饲料，母
猪泌乳期的使用更达70%以上。
另外，法国、瑞典、西
班牙也陆续开始使用微生物发酵饲料。
饲料发酵目前
主要采用液态发酵和固态发酵两种工艺，液态发酵
（SubmergedFermentation,SmF）具有周期短、易控制、
微生物的繁殖重复性强等优点，但需要配套昂贵的系
统设备，难以被大众所接受；固态发酵（SolidState
Fermentation,SSF）具有培养基简单，基料来源广泛；投
资少，能耗低，操作方便等优点，但劳动强度大，难以
与现实规模化养殖生产所需的系列化日粮配合加工
结合。
为此，本课题设计饲料液态发酵转固态发酵新
工艺并展开了系列研究。
试验以植物乳杆菌（Lacto－
bacillusplantarum）和致病性大肠杆菌E.colik88为指
示菌株，研究在液态转固态发酵饲料中目标益生菌和
指示菌的动态变化情况，为建立适合我国养殖生产条
件的生物发酵饲料新工艺提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌株来源
植物乳杆菌由湖北省农业科学院畜牧兽医研究
所分离、鉴定并保存；大肠杆菌E.colik88购于中国兽
医药品监察所。
1.1.2培养基选择及菌株培养
参照何涛等介绍的方法，植物乳杆菌采用MRS
培养基，大肠杆菌E.colik88采用伊红美兰培养基培养。
1.1.3主要仪器设备
超净工作台（苏州安泰SW-CJ-1CU型）、酸度计
（上海理达PHS-25C型）、高压蒸汽灭菌锅（上海申安
ZDX-35BI型）、恒温培养箱（黄石恒丰SP-01型）、
微型发酵瓶（罐头瓶）。
1.1.4发酵基料设计原则
以生长后期仔猪配合饲料为发酵的基础原料，即
不含预混料的配合饲料（配方见表1）。
在此基础上，
制备如下三种发酵基料，①固态发酵基料：
为不含微
量元素、维生素、矿物质的配合饲料；②液态发酵基
料：
玉米、豆粕按质量分数1：
3混合均匀；③液态转
固态发酵基料：
为固态发酵基料中减去液态发酵基料
的部分。
《饲料工业》·2011年第32卷第5期
试验研究
30表1固态发酵基料配方
原料名称
玉米
豆粕
鱼粉
麸皮
膨化大豆
比例（%）
66
18
3
5
8
1.2试验方法
1.2.1试验设计与方案
采用2因子试验设计。
研究了2种发酵温度（20℃，
T1；30℃，T2）下，不同发酵工艺（液态转固态发酵和固
态发酵）对pH值及菌落数的影响，设计方案见表2。
表2设计方案
发酵温度
T1（20℃）
T2（30℃）
发酵工艺
液态转固态发酵
固态发酵
液态转固态发酵
固态发酵
1.2.2试验操作方法
1.2.2.1液态转固态发酵工艺操作方法
第一阶段（液态发酵）：
称取20g液态发酵基料
于微型发酵瓶中，以料水比1：
3.5加入70g水，按
10
6
cfu/g物料接入植物乳杆菌，在25℃的恒温条件下
静置培养48h。
第二阶段（固态发酵）：
直接在液态发酵料中加入
80g的固态配合料，搅拌均匀，使终水分在40%左右。
并按每10
6
cfu/g物料接种E.colik88，密封置恒温培养
箱中培养。
1.2.2.2固态发酵工艺操作方法
与液态转固态发酵工艺的第二个阶段同时进行，
具体操作如下：
称取20g液态发酵基料和80g的固
态配合料于微型发酵瓶中，加入一定质量的水，使终
水分在40%左右，按10
6
cfu/g物料分别接种植物乳杆
菌和E.colik88，搅拌均匀，密封置恒温培养箱中培养。
1.2.3指标测定
分别于固态发酵开始后第0、24、48、72、120、168h
无菌取样，进行pH值和微生物的测定。
pH值测定：
取鲜样10g，用100ml蒸馏水浸提1~
2min后，经纱布过滤，水浸液当即用酸度计测定pH值。
微生物测定采用10倍稀释法，植物乳杆菌测定
应用MRS琼脂培养基，37℃培养36h，大肠杆菌E.
colik88测定采用EMB培养平板，37℃培养24h。
1.3数据处理
微生物及pH值数据采用SAS6.12的t-test过程
进行两组均数的差异显著性检验。
2结果与分析
2.1发酵过程中pH值的动态变化
2.1.1不同发酵工艺对pH值的影响（见表3）
在发酵过程中，液态转固态发酵起始（0h）pH值
明显优于固态发酵，差异显著（P＜0.05）。
在随后的发
酵时间里，2个发酵温度下，液态转固态发酵和固态
发酵pH值差异都不显著（P＞0.05）。
这主要是因为液
态转固态发酵工艺中接种的益生菌株植物乳杆菌
发酵过程中产生的乳酸、乙酸等有机酸成分，在液
态转固态发酵时直接降低了饲料的pH值。
因而
随着发酵时间的延长，pH值趋向一致，所以差异不
显著。
2.1.2不同发酵温度对pH值的影响（见图1）
7
6
5
4
3
2
1
0
p
H
值
0244872120168
液态转固态发酵T1
液态转固态发酵T2
固态发酵T1
固态发酵T2
时间（h）
图1不同发酵温度对pH值的影响
168
4.05±0.05
a
3.96±0.04
a
3.94±0.03
a
4.01±0.02
a
表3不同发酵处理对pH值的影响
0
5.82±0.02
a
6.40±0.03
b
5.82±0.02
a
6.40±0.03
b
24
4.54±0.10
a
4.49±0.01
a
4.22±0.04
a
4.19±0.01
a
48
4.28±0.06
a
4.29±0.05
a
3.97±0.03
a
3.96±0.05
a
72
4.15±0.02
a
4.15±0.02
a
3.86±0.01
a
3.87±0.02
a
120
3.95±0.01
a
3.94±0.06
a
3.90±0.04
a
3.86±0.04
a
T1
液态转固态发酵
固态发酵
T2
液态转固态发酵
固态发酵
项目
培养时间（h）
注：
同一温度下同列标注字母不同者差异显著（P＜0.05）。
下表同。
杨雪海等：
饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响
试验研究
31从图1可见，液态转固态发酵和固态发酵在T1、
T2两个发酵温度下随发酵时间的延续均表现出逐渐
下降的趋势，在120h时降到最低，随后出现轻微的
上升。
在24、48、72h三个时间点两种发酵工艺的pH值
T2明显低于T1（P＜0.05），在随后的时间未表现出明
显的差异（P＞0.05）。
2.2发酵过程中植物乳杆菌菌数变化
2.2.1不同发酵工艺对植物乳杆菌菌数的影响（见表4）
从表4可知，发酵温度为20℃（T1）时，48h以前
2种发酵工艺的植物乳杆菌菌数差异显著（P＜0.05），
72h以后的各点差异不显著；而发酵温度为30℃
（T2）时，24h以前2种发酵工艺的植物乳杆菌菌数差
异显著（P＜0.05），24h以后的各点差异不显著。
2.2.2不同发酵温度对植物乳杆菌菌数的影响（见图2）
12
10
8
6
4
2
0
菌
数
（
l
o
g
c
f
u
/
g
）
0244872120168
液态转固态发酵T1
液态转固态发酵T2
固态发酵T1
固态发酵T2
时间（h）
图2不同发酵温度对植物乳杆菌菌数的影响
从图2可知，在72h以内，液态转固态发酵和固
态发酵植物乳杆菌数菌数在T1、T2发酵温度下未表
现明显差异（P＞0.05）。
但在随后的发酵时间里，表现出
显著的差异（P＜0.05）。
T1发酵温度下的植物乳杆菌菌
数优于T2发酵温度。
2.3发酵过程中E.colik88的菌数变化
2.3.1不同发酵工艺对E.colik88菌数的影响（见表5）
由表5可见，在T1发酵温度下，液态转固态发酵
工艺和固态发酵工艺大肠杆菌E.colik88菌数表现出
较大的差异。
液态转固态发酵大肠杆菌E.colik88呈
直线下降趋势，在72h降到检测限以下，固态发酵则
表现为先上升后下降趋势，固态发酵在120h才降为
检测限以下。
在T2发酵温度下，2种发酵工艺大肠杆
菌E.colik88菌数在发酵24h时差异显著（P＜0.05），随
后均降为检测限以下。
2.3.2不同发酵温度对E.colik88菌数的影响（见图3）
从图3可见，液态转固态发酵大肠杆菌E.coli
k88的菌数在T1、T2发酵温度下，呈直线下降趋势，
在T1温度下72h降到检测限以下，而在T2温度下
48h就降到了检测限以下。
固态发酵E.colik88菌数
则表现为先上升后下降，在T1温度下，48h达到最高
值，随后出现下降，120h降到检测限以下，在T2温度
168
9.59±0.17
a
9.54±0.20
a
8.91±0.12
a
8.93±0.09
a
表4不同发酵处理对植物乳杆菌菌数的影响（logcfu/g）
0
8.20±0.20
a
6.15±0.15
b
8.20±0.20
a
6.15±0.15
b
24
9.53±0.10
a
9.41±0.11
b
9.63±0.23
a
9.49±0.14
b
48
9.62±0.08
a
9.47±0.09
b
9.59±0.09
a
9.57±0.21
a
72
9.63±0.23
a
9.54±0.14
a
9.60±0.18
a
9.53±0.05
a
120
9.56±0.14
a
9.56±0.17
a
8.86±0.08
a
8.93±0.13
a
T1
固态发酵
液态转固态发酵
T2
固态发酵
液态转固态发酵
项目
培养时间（h）
168
＜3.0±0.00
＜3.0±0.00
＜3.0±0.00
＜3.0±0.00
表5不同发酵工艺对E.colik88菌数的影响（logcfu/g）
0
6.00±0.12
a
6.00±0.12
a
6.00±0.12
a
6.00±0.12
a
24
5.96±0.15
a
7.00±0.05
b
4.40±0.20
a
6.85±0.15
b
48
5.10±0.08
a
8.30±0.15
b
＜3.0±0.00
＜3.0±0.00
72
＜3.0±0.00
5.45±0.08
a
＜3.0±0.00
＜3.0±0.00
120
＜3.0±0.00
＜3.0±0.00
＜3.0±0.00
＜3.0±0.00
T1
液态转固态发酵
固态发酵
T2
液态转固态发酵
固态发酵
项目
培养时间（h）
注：
“＜”表示当微生物的数目低于检测限时，该微生物数目用检测限表示。
大肠杆菌的检测限为3.0logcfu/g。
数据以“平均
值±标准差”的形式表示。
杨雪海等：
饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响
试验研究
32下，24h升到最高值，随后降为检测限以下。
0244872120168
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
E
.
c
o
l
i
k
8
8
菌
数
（
l
o
g
c
f
u
/
g
）
液态转固态发酵T1
液态转固态发酵T2
固态发酵T1
固态发酵T2
时间（h）
图3不同发酵温度对E.colik88菌数的影响
3讨论
有些发酵饲料的加工并不是人为接种微生物，这
种发酵叫做自然发酵。
目前国外大多数液态发酵饲料
采用这种发酵方式。
但是自然发酵的方向不容易控
制，结果可预见性比较差。
微生物接种发酵做为一种
新型的发酵方式，在优化的发酵条件下，可以产生预
见性更强的发酵结果。
因此本试验比较了在不同的发
酵温度下，微生物接种后进行液态转固态发酵和固态
发酵两种不同的发酵工艺对发酵过程中的pH值、乳
酸菌菌数及E.colik88菌数的影响。
3.1酸化日粮能改善动物消化机能
研究表明，只有动物消化道pH值稳定在适合的
范围内，才能维持正常的消化生理，pH值过高能显著
地抑制胃蛋白原的活化，当pH值高于6时，胃蛋白就
会失活。
发酵饲料较低的pH值满足动物的这种需要。
试验中液态转固态发酵和固态发酵均能在24h内使
pH值降到4.5以下，随着发酵温度的升高降低的幅度
更大，并且相同时间内30℃的发酵温度pH值要低于
20℃的。
在固态发酵过程中，液态转固态发酵起始pH
值优于直接固态发酵（P＜0.05），主要是因为在液态转
固态发酵工艺中，液态发酵产生的乳酸、乙酸等短链
脂肪酸在转固态发酵时具有明显的酸化日粮的作用。
3.2发酵影响乳酸菌数
乳酸菌由于其具有降低消化道内pH值、抑制其
它病原性微生物生长、保持或恢复肠道内微生物群落
的平衡、防病促生长等作用，现已被广泛应用于食品
加工、医药保健、饲料发酵及畜禽疾病防治等方面。
有资
料报道，益生菌发挥功能的最低剂量为6logcfu/g，因此，
其数量就成为各种产品追求的主要指标。
本次试验
中，液态转固态发酵和固态发酵乳酸菌数均达到了
9.5logcfu/g左右，这与VanWinsen（2002）、Demeckova
（2006）等所报道的乳酸细菌数9.4logcfu/g相一致。
在
固态发酵的初始阶段，液态转固态发酵工艺乳酸菌数
优于直接固态发酵（P＜0.05），随后无明显差异（P＞
0.05）。
这是因为在液态转固态发酵工艺中液态发酵过
程使乳酸菌得到大量的增值，所以在转固时较直接固
态发酵乳酸菌数占明显优势，随着发酵的过程进行乳
酸细菌数趋向一致。
3.3发酵过程中不同菌增殖特点
饲料和水接触后，发酵即开始。
在发酵的起始阶
段，发酵饲料以低的乳酸菌含量、高的pH值和大肠
杆菌的增值为特点。
随后发酵将进入一个稳定阶段，
以高的乳酸菌和低的大肠杆菌含量为特点。
试验中
固态发酵大肠杆菌E.colik88出现先增殖后下降的趋
势，这与Jensen（1998）、Canibe（2003）报道的相一致。
而液态转固态发酵指示菌株E.colik88成直线下降趋
势，对E.colik88有明显的抑制作用。
这可能是在液态
发酵过程中，接种的植物乳杆菌发酵代谢产生的乳
酸、乙酸、双乙酰以及一些细菌素类物质在转固发酵
过程中直接起到了抑制和杀菌作用。
Winsen等的研
究发现，使用胚芽乳杆菌（L．plantarum）发酵猪饲料的
前2h内具有抑菌作用，再往后就表现出杀菌效果。
3.4发酵温度是影响发酵效果的重要因素
在最适温度范围内，随着温度的升高，菌体生长
和代谢加快，发酵反应的速率加快。
当超过最适温度
范围以后，随着温度的升高，菌体衰老加快，发酵周期缩
短。
试验中选择了20℃和30℃两个不同的发酵温度，
从饲料的pH值变化和乳酸菌数来看，30℃的发酵温
度下饲料pH值比20℃的降低幅度大，乳酸菌数的衰
老情况也较严重，在检测时间内，出现明显的先升高
后下降的趋势，但并未发现两种发酵工艺间存在显著
差异。
从对E.colik88的抑制效果来看，30℃的发酵温
度要优于20℃的，主要是因为温度的升高，菌体衰老
加快，再加上乳酸细菌对其的抑制，双重作用使得其
在短时间内就降为检测限以下。
因此在生产中，可根
据实际需要选择合适的发酵温度。
4小结
液态转固态生产发酵饲料的工艺，综合了液态发
酵和固态发酵的优点，使物料的起始pH值降低，加之
液态发酵产物的综合作用，改变了饲料原料中致病性
大肠杆菌等杂菌的生存环境，使其失去增殖条件，呈
现对原料杂菌的明显抑杀作用。
这对提高益生菌发酵
饲料的生物安全性具有重要意义。
（参考文献12篇，刊略，需者可函索）
（编辑：
刘敏跃，lm-y@）
杨雪海等：
饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响
试验研究
33
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