食品中双酚A的测定高效液相色谱串联质谱法征求意见稿.docx

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食品中双酚A的测定高效液相色谱串联质谱法征求意见稿

DB

北京市食品安全地方标准

DB11/XXXXX—XXXX

食品安全地方标准

食品中双酚A的测定

高效液相色谱/串联质谱法

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布

XXXX-XX-XX实施

北京市卫生和计划生育委员会发布

前  言

本标准为首次发布。

食品安全地方标准

食品中双酚A的测定高效液相色谱/串联质谱法

1　范围

本标准规定了多类食品中双酚A（BPA）痕量检测的制样方法和高效液相色谱/串联质谱检测方法。

本标准适用于动物肌肉、鸡蛋、奶粉、牛奶、植物油、粮谷以及酒水饮料等食品中BPA的高效液相色谱/串联质谱确证和测定。

2　原理

试样中目标化合物经有机溶剂提取，利用凝胶渗透色谱或固相萃取技术净化，高效液相色谱/串联质谱仪测定，同位素稀释内标法定量。

3　试剂和材料

除非另有说明，本法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。

3.1　试剂

甲醇。

乙腈。

水。

乙酸乙酯。

环己烷。

3.2　试剂配制

乙酸乙酯-环己烷溶液（1+1，体积比）

取50mL乙酸乙酯与50mL环己烷混合。

甲醇-水溶液（1+1，体积比）

取50mL甲醇与50mL水混合。

3.3　标准品

双酚A（BPA,CAS:

80-05-7，分子量：

228，纯度≥98.5%）。

双酚A氘代同位素内标（BPA-d4,CAS：

347841-41-2，分子量：

232，纯度≥97.8%）或相当者。

3.4　标准溶液配制

标准储备液

准确称取10.0mg的标准品（3.3.1）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1mg/mL的标准储备液，-18℃以下保存，在12个月内稳定。

内标储备液

准确称取10.0mg的同位素内标（3.3.2）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1mg/mL的标准储备液，-18℃以下保存，在12个月内稳定。

中间浓度标准溶液

用甲醇将标准储备液配制成浓度为1μg/mL的中间浓度标准溶液，4℃以下保存，在3个月内稳定。

中间浓度内标溶液

用甲醇将内标储备液配制成浓度为200μg/L的中间浓度内标溶液，4℃以下保存，在3个月内稳定。

标准工作溶液

根据需要，吸取一定量的中间浓度标准溶液（3.4.3）和中间浓度内标溶液（3.4.4），用甲醇配置成适当浓度的标准工作溶液（0.2、0.5、1、2、5、10、20μg/L）并使得每个浓度点内标浓度均为10μg/L。

使用当天配制。

3.5　材料

OasisHLB固相萃取柱（200mg，6mL）或相当者

使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化。

BondElutPlexa固相萃取柱（200mg，6mL）或相当者

使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化。

4　仪器和设备

4.1　高效液相色谱/串联四极杆质谱仪：

配电喷雾离子源。

4.2　电子天平：

感量为0.0001g和0.01g。

4.3　组织匀浆机。

4.4　漩涡混合器。

4.5　冷冻离心机（最大转速10000r/min）。

4.6　氮吹仪。

4.7　固相萃取真空装置。

4.8　超声提取仪。

4.9　旋转蒸发仪。

4.10　凝胶渗透色谱仪：

配玻璃样品管。

4.11　移液器。

4.12　粉碎机。

5　分析步骤

5.1　试样制备

样品准备

5.1.1.1　动物肌肉

从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，剔除筋膜。

用组织匀浆机充分捣碎均匀，装入洁净容器中，密封并标明标记，于-18℃以下冷冻保存，一周内进行处理。

5.1.1.2　鸡蛋

从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，去壳后用组织匀浆机充分搅拌均匀，装入洁净容器中，密封并标明标记，于4℃以下冷藏保存，两天内进行处理。

5.1.1.3　奶粉及牛奶

从所取全部奶粉样品中取出有代表性样品约500g，混合均匀后装入洁净容器中，密封并标明标记，于4℃以下保存，一周内进行处理。

牛奶样品经冷冻干燥制成粉末，研磨均匀，保藏及处理方法同奶粉样品。

5.1.1.4　植物油

将所取样品装入洁净容器中，密封并标明标记，常温保存，一周内进行处理。

5.1.1.5　粮谷

从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，用粉碎机充分粉碎均匀，装入洁净容器中，密封并标明标记，于4℃以下保存，一周内进行处理。

5.1.1.6　酒水饮料

碳酸饮料超声20min去除二氧化碳，果汁饮料等含固形物饮料于5000r/min下离心15min后取上清，白酒样品用超纯水以1:

1稀释。

于4℃以下密封保存于净容器中，，一周内进行处理。

提取

5.1.1.7　动物肌肉、鸡蛋、奶粉

动物肌肉、鸡蛋样品分别称取4g（精确至0.01g）、奶粉试样称取2g（精确至0.01g），置于50mL离心管中，加入100μL中间浓度内标溶液（3.4.4）和10mL乙酸乙酯-环己烷溶液（3.2.1），涡旋混匀，超声提取20min，于4℃9000r/min离心15min，上清液尽数转移至凝胶渗透色谱仪上样管中，待净化。

5.1.1.8　植物油

取植物油样品0.8g（精确至0.01g）于凝胶渗透色谱仪上样管中，加入100μL中间浓度内标溶液（3.4.4）和10mL乙酸乙酯-环己烷溶液（3.2.1），2000r/min涡旋混合1min,待净化。

5.1.1.9　粮谷

称取试样1g（精确至0.01g），置于15mL离心管中，加入50μL中间浓度内标溶液（3.4.4）和6.0mL乙腈（3.1.2），超声提取20min，4℃下9000r/min离心10min，取上清液。

剩余残渣照上述方法重复提取一次。

合并2次提取液并用高纯氮气缓慢吹至1mL，用水定容至5mL，待净化。

净化

5.1.1.10　动物肌肉、鸡蛋、奶粉

将5.1.2.1项所得上清液用凝胶渗透色谱仪进行净化。

采用苯乙烯树脂BiobeadSX-3（300×10mm）凝胶色谱柱（或相当柱），流动相为乙酸乙酯-环己烷溶液（3.2.1），流速3.0mL/min，进样量5mL。

收集14～17min组分于100mL玻璃茄形瓶中，30℃120r/min旋转蒸发至干，1mL甲醇定容后上机检测。

5.1.1.11　植物油

将5.1.2.2项所得混合液用于凝胶渗透色谱仪净化，净化步骤同5.1.3.1。

5.1.1.12　粮谷

将5.1.2.3项所得定溶液5mL上样于活化后的OasisHLB固相萃取柱（3.5.1），上样后用6mL甲醇-水溶液（3.2.2）淋洗，最后用6mL甲醇洗脱，洗脱液收集后氮吹至干，用1mL甲醇溶解，涡旋混合30s，待测。

5.1.1.13　酒水饮料

取样品10mL，加入50μL中间浓度内标溶液（3.4.4），涡旋混匀。

上样于活化后的BondElutPlexa固相萃取柱（3.5.2），上样后依次用10mL甲醇-水溶液（3.2.2）和10mL水淋洗，最后用6mL甲醇洗脱，洗脱液收集后氮吹至干，用1mL甲醇溶解，涡旋混合30s，待测。

5.2　仪器参考条件

高效液相色谱条件

高效液相色谱条件如下：

——色谱柱：

WatersACQUITYUPLCTMBEHC18柱（50mm×2.1mm，1.7μm）或其它等效柱；

——流动相：

A，甲醇；B，水。

梯度淋洗，参考梯度条件参见表1；

——流速：

0.3mL/min；

——柱温：

40℃；

——进样体积：

5μL。

质谱条件如下

质谱条件如下所示：

——电离源：

电喷雾负离子模式；

——毛细管电压：

2.8kV；

——射频透镜电压：

0V；

——源温度：

150℃；

——脱溶剂气温度：

400℃；

——脱溶剂气流量：

1000L/h；

——碰撞室压力：

3.1×10-3mbar；

——目标化合物的特征离子参见表2。

5.3　标准曲线的制作

按浓度由小到大的顺序，将标准系列工作溶液（3.4.5）分别注入高效液相色谱/串联质谱仪中，测定BPA及其内标峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以目标化合物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

标准溶液的液相色谱-质谱/质谱多反应监测（MRM）色谱图参见图C。

5.4　定性及定量

保留时间

被测试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在±2.5%之内。

信噪比

待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N≥3）。

定量离子、定性离子及子离子丰度比

目标化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表1规定的范围。

表1　定性时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度

＞50%

＞20%至50%

＞10%至20%

≤10%

允许相对偏差

±20%

±25%

±30%

±50%

5.5　试样溶液的测定

将试样溶液注入高效液相色谱/串联质谱仪中，得到目标化合物峰面积与内标峰面积的比值，根据标准曲线得到待测液中目标化合物的浓度，平行测定次数不少于两次。

6　分析结果的表述

按式

（1）计算动物肌肉、鸡蛋、奶粉和植物油中BPA残留量：

（1）

按式

（2）计算粮谷和酒水饮料中BPA残留量：

（2）

式中：

X——试样中BPA残留量，单位：

固体为微克每千克（μg/kg），液体为微克每升（μg/L）；

c——由回归曲线计算得到的上机试样溶液中BPA的浓度，单位为微克每升（μg/L）；

V——试样的定容体积，单位毫升为（mL）；

m——试样的质量，单位为克（g）。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值标示，结果保留三位有效数字。

7　测定低限

按能够准确确认的目标化合物浓度来估计目标化合物在不同样品基质中的测定低限。

样品基质、取样量、色谱分离状况、电噪声水平以及仪器灵敏度均可能对样品的测定低限造成影响，因此噪声水平应从实际样品谱图中获取。

采用上述方法，双酚A在不同基质中的测定低限分别为动物肌肉0.3μg/kg，鸡蛋0.5μg/kg，奶粉0.5μg/kg，牛奶0.05μg/kg，植物油1.0μg/kg，粮谷0.5μg/kg，酒水饮料0.15μg/L。

8　准确度和精密度

回收率试验采用三个加标浓度,每个浓度六个平行。

不同基质中双酚A的加标回收率在85.9%～119.9%之间，相对标准偏差为2.1%～17.0%,具体见表4。

附录A

（资料性附录）

BPA参考液相条件

表2　ABPA分离参考梯度条件

时间/min

甲醇/%

水/%

0

35

65

2

90

10

5

100

0

7

100

0

7.1

35

65

9

35

65

附录B

（资料性附录）

质谱参考条件

表3　BBPA及氘代BPA质谱参考条件

化合物

母离子

子离子

碰撞能量/eV

锥孔电压/V

BPA

227.2

212.1*

26

30

133.0

18

30

氘代BPA

231.2

216.0

20

30

注：

表C中带*的离子为定量离子；对不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳；表B所列质谱参考条件是在WatersXevo™TQ-S质谱仪上完成的，此处所列试验用仪器型号仅供参考，不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号仪器。

附录C

（资料性附录）

标准物质的MRM谱图

图1　CBPA标准溶液多反应监测（MRM）色谱图（10μg/L）

附录D

（资料性附录）

食品基质中BPA的加标回收率和相对标准偏差

表4　不同食品基质中双酚A的回收率及相对标准偏差（n=6）

食品基质

加标水平/（μg/kg）

回收率/%

RSD/%

鸡肉

0.2

94.9

17

1

106.6

8.6

4

85.9

4.3

鸡蛋

0.2

102.7

15

1

99.5

17

4

103.8

6.1

奶粉

0.4

109.1

7.2

2

109.6

13

8

102.9

10

玉米油

2

106.5

7.9

5

101.9

10.6

10

94.7

7.7

玉米面

0.5

110.2

9.7

1

105.8

12.6

2.5

106.4

9.8

面粉

0.5

119.2

11.8

1

119.9

6.2

2.5

98.1

15.1

大米

0.5

104.2

11.4

1

106

6.3

2.5

115.6

6.6

碳酸饮料

0.5

95.4

2.3

1

92.2

7.3

2.5

94.4

5

果汁

0.5

101.2

6.4

1

111

4.7

2.5

96.3

5.2

白酒

0.5

104.1

2.1

1

103

3.3

2.5

97.1

2.1

注：

酒水及饮料类食品的加标水平单位为μg/L