真菌细胞壁AGSNP对桦褐孔菌次生代谢产物的影响1108.docx
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真菌细胞壁AGSNP对桦褐孔菌次生代谢产物的影响1108
真菌激发子、AG、SNP对桦褐孔菌次生代谢产物的影响-2008-11-08
第一部分：
桦褐孔菌菌种的制作
1：
桦褐孔菌（WTC）采自牡丹江镜泊湖火山口，标本由俄罗斯真菌专家MargaritaA.Bondartseva教授鉴定，保存于江苏省药用植物生物技术重点实验室（编号：
LBMP2004005），菌种从液氮中取出经PDA斜面纯化培养后接入液体培养基。
2：
液体培养基的制作：
计算和称取：
每个三角烧瓶盛放200毫升培养液，10个三角烧瓶放2000毫升培养液。
物质名称：
计算方法：
结果：
葡萄糖
2000克x2%
40克
酵母膏
2000克X0.1%
2克
蛋白栋
2000克X0.35%
7克
KH2PO4
2000克X0.1%
2克
MgSO4·H2O
2000克X0.05%
1克
CaCl2
2000克X0.01%
0.2克
（NH4）2SO4
2000克X0.02%
0.4克
将40克葡萄糖放入一个500毫升三角烧瓶内，加入100毫升纯净水溶解，棉球封口后锡纸外包，可以放在烘箱（50~60℃）中加热帮助溶解。
（暂时不和其他物质混合以防发生化学反应）。
将其余药品倒入1000毫升烧杯中，将药品加纯净水至900毫升溶解后倒入烧杯中，用玻璃棒搅拌后放入超声清洗器中（功率70%）帮助混合均匀。
再分别加入100毫升纯净水。
将烧杯中900毫升液体分装在10个三角烧瓶中→→向每个三角烧瓶中加入100毫升纯净水→→棉球封口。
→→锡纸包外。
→→将真菌过滤器用报纸包外，并用绳子扎紧→→将5只枪头和1把勺子用锡纸包外→→用2只500毫升三角烧瓶各装入300毫升纯净水，塞紧棉球，锡纸外包。
3高温灭菌：
将下列物品放入高温蒸汽灭菌器灭菌。
操作如下：
名称
数量
名称
数量
名称
数量
培养液（390mL）
10瓶
葡萄糖（100mL）
1瓶
勺子
1把
纯净水（300mL）
2瓶
枪头
5只
细胞过滤器
1只
将上述物品放入灭菌器中，可以倾斜，但要防止药品流出。
最上端用报纸覆盖，防止水滴下落导致灭菌器灭菌无效。
打开进水口阀门，加水至最上端刻度线处，加水后关闭阀门。
将旋钮从干燥旋转到灭菌（直至难以旋转为止）旋紧舱盖，打开上端封口和下端接水口。
打开电源。
约30~50min后，上端封口和下端接水口冒热气时，关闭上端封口和下端接水口。
定时时间一到，灭菌器发出鸣声（约50分钟后），将旋钮旋向干燥。
约40min后，灭菌器压力降至0，打开上端封口放气。
放完气后打开下端接水口放水。
放完水后关闭电源。
打开灭菌器舱盖冷却一会儿，再将灭菌物品拿出即可。
4：
紫外灭菌：
紫外线灭菌法：
是指用紫外线照射杀死微生物的方法。
本法适用于物体表面之灭菌，无菌室空气及蒸馏水的灭菌；普通玻璃可吸收紫外线，因此装于容器中的药物不能灭菌。
紫外线对人体照射过久会发生结膜炎，红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在操作前开启1—2小时灭菌而在操作时关闭。
操作方法：
产品电源线插头接通220V、50HZ电源。
打开照明灯，将灭菌物品：
10瓶培养液（390mL），1瓶葡萄糖（100mL），2瓶纯净水（300mL），5只枪头，1把勺子，1只过滤器，1只5ml的枪等放入灭菌室。
按下黄色开关，此时紫外盘形灯管发出淡蓝色的光，即可使用。
打开室内和走廊上的紫外灯。
（无菌操作注意：
每次进入无菌操作室，关闭紫外灯（上面两开关）；每次出无菌操作室，打开紫外灯（上面两开关）；操作前，将酒精灯注入酒精，然后将酒精灯和打火机带入紫外操作室，过一会儿（约30min）做实验；用菌球接种可得到大小不同的真菌，用菌丝接种可得到大小相同的真菌。
5：
接种WTC（中国野生型）,WTF（芬兰野生型）,FBCC（芬兰教授培养出的品种），实验30分钟前，关闭所有紫外灯。
将菌种拿入无菌操作台，并用75%酒精将手消毒。
点燃酒精灯，将盛100毫升葡萄糖溶液的三角烧瓶开启后消毒，装上枪头。
开启10瓶装培养液的三角烧瓶，各加入10毫升葡萄糖溶液，如有多余，继续平均分装。
用专用细胞过滤器过滤菌种，并用消毒纯净水洗涤。
将菌种平均分装在10瓶培养液中。
将棉球用火消毒后封闭10个三角烧瓶，并将锡纸消毒外包。
将所有物品拿出无菌室。
6.：
上摇床：
关闭摇床电源。
将10个三角烧瓶插入摇床，注意距离，以防碰碎。
开启电源。
功能---调节温度26℃----DATA，功能---调节转速140rpmin---DATA，关闭密封门，洗涤仪器--（先用洗洁精---自来水---纯净水）。
第二部分：
接种桦褐孔菌并摇床培养
1：
计算和称取：
每个三角烧瓶盛放200毫升培养液，21个三角烧瓶放4200毫升培养液。
物质名称：
计算方法：
结果：
葡萄糖
4200克x2%
84克
酵母膏
4200克X0.1%
4.2克
蛋白栋
4200克X0.35%
14.7克
KH2PO4
4200克X0.1%
4.2克
MgSO4·H2O
4200克X0.05%
2.1克
CaCl2
4200克X0.01%
0.42克
（NH4）2SO4
4200克X0.02%
0.84克
将84克葡萄糖放入一个500毫升玻璃瓶内，加入200毫升纯净水溶解，锡纸外包，（可以放在烘箱（50~60℃）中加热帮助溶解）。
（暂时不和其他物质混合以防发生化学反应）。
将其余药品倒入1000毫升烧杯中，将药品加纯净水至900毫升溶解后倒入烧杯中，用玻璃棒搅拌后放入超声清洗器中（功率70%）帮助混合均匀。
将烧杯中900毫升液体分装在21个三角烧瓶中→→向每个三角烧瓶中加入150毫升纯净水→→棉球封口。
→→锡纸包外。
→→将真菌过滤器用报纸包外，并用绳子扎紧→→将4只5毫升枪头（2个剪口，2个平口）和1把勺子用锡纸包外→→用2只500毫升三角烧瓶各装入300毫升纯净水，塞紧棉球，锡纸外包。
2：
高温灭菌：
将下列物品放入高温蒸汽灭菌器灭菌。
操作如下：
名称
数量
名称
数量
名称
数量
培养液（390mL）
20瓶
葡萄糖（200mL）
1瓶
勺子
1把
纯净水（300mL）
2瓶
枪头
4只
细胞过滤器
1只
将上述物品放入灭菌器中，可以倾斜，但要防止药品流出。
最上端用报纸覆盖，防止水滴下落导致灭菌器灭菌无效。
打开进水口阀门，加水至最上端刻度线处，加水后关闭阀门。
将旋钮从干燥旋转到灭菌（直至难以旋转为止）旋紧舱盖，打开上端封口和下端接水口。
打开电源。
约30~50min后，上端封口和下端接水口冒热气时，关闭上端封口和下端接水口。
定时时间一到，灭菌器发出鸣声（约50分钟后），将旋钮旋向干燥。
约40min后，灭菌器压力降至0，打开上端封口放气。
放完气后打开下端接水口放水。
放完水后关闭电源。
打开灭菌器舱盖冷却一会儿，再将灭菌物品拿出即可。
3：
紫外灭菌：
紫外线灭菌法：
是指用紫外线照射杀死微生物的方法。
本法适用于物体表面之灭菌，无菌室空气及蒸馏水的灭菌；普通玻璃可吸收紫外线，因此装于容器中的药物不能灭菌。
紫外线对人体照射过久会发生结膜炎，红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在操作前开启1—2小时灭菌而在操作时关闭。
操作方法：
产品电源线插头接通220V、50HZ电源。
打开照明灯，将灭菌物品：
20瓶培养液（390mL），1瓶葡萄糖（200mL），2瓶纯净水（300mL），4只枪头，1把勺子，1个过滤器，1只5ml的枪等放入灭菌室。
按下黄色开关，此时紫外盘形灯管发出淡蓝色的光，即可使用。
打开室内和走廊上的紫外灯。
（无菌操作注意：
每次进入无菌操作室，关闭紫外灯（上面两开关）；每次出无菌操作室，打开紫外灯（上面两开关）；操作前，将酒精灯注入酒精，然后将酒精灯和打火机带入紫外操作室，过一会儿（约30min）做实验。
）
4：
接种WTC（中国野生型），实验30分钟前，关闭所有紫外灯。
将菌种拿入无菌操作台，并用75%酒精将手消毒。
点燃酒精灯，将盛200毫升葡萄糖溶液的三角烧瓶开启后消毒，装上枪头。
开启20瓶装培养液的三角烧瓶，各加入10毫升葡萄糖溶液，如有多余，继续平均分装。
用专用细胞过滤器过滤菌种，并用消毒纯净水洗涤。
将菌种平均分装在6瓶培养液中。
将棉球用火消毒后封闭20个三角烧瓶，并将锡纸消毒外包。
将所有物品拿出无菌室。
5.：
摇床培养：
关闭摇床电源。
将20个三角烧瓶插入摇床，注意距离，以防碰碎。
开启电源。
功能---调节温度26℃----DATA，功能---调节转速140rpmin---DATA，关闭密封门，洗涤仪器--（先用洗洁精---自来水---纯净水）。
6：
加入刺激因子实验操作
：
支链胞霉45微克/毫升（每200毫升培养液加入1.125毫升）。
：
支链胞霉45微克/毫升+氨基胍（20毫摩尔/升）。
：
支链胞霉45微克/毫升+硝普纳（2毫摩尔/升）。
：
支链胞霉45微克/毫升+硝普纳+氨基胍
：
对照组
药品用量：
硝普纳（2毫摩尔/升）2*0.001*297.75*1000/5=119.1毫克，按13瓶计算：
将1548.3毫克的硝普纳溶解于39毫升的灭菌水中，每瓶加入3毫升，氨基胍（10毫摩尔/升）10*0.001*137.11*1000/5=274.22毫克，按13瓶计算：
将3564.86毫克的氨基胍溶解于39毫升的灭菌水中，每瓶加入3毫升。
第三部分：
时取样
24小时取样（2008-09-23-17-30——2008-09-24-17-30）
17：
30
21：
30
01：
30
05：
30
09：
30
13：
30
17：
30
名
称
体
积
名称
体
积
名
称
体积
名称
体积
名
称
体积
名称
体积
名称
体积
1
20
16
19.5
31
18
46
19
61
21.5
76
22
91
19
2
19
17
19
32
21.5
47
17.5
62
22
77
18.5
92
21.5
3
19
18
20
33
19
48
22
63
18
78
21
93
17
4
18.5
19
22.5
34
18
49
21.5
64
18
79
20
94
20
5
18.5
20
23
35
23
50
19.5
65
20
80
20
95
22
6
17.5
21
23
36
20
51
21
66
22
81
18
96
19
7
17.5
22
21.5
37
20.5
52
20
67
22
82
23
97
22
8
18
23
20
38
18
53
18
68
21
83
22
98
21
9
18
24
22
39
22.5
54
20
69
22
84
20
99
20
10
17
25
20
40
20
55
23
70
20.5
85
19.5
100
21
11
17
26
18
41
23
56
22
71
17
86
21
101
23
12
18
27
21
42
20
57
21
72
20
87
20
102
23
13
19
28
21
43
21.5
58
23
73
20
88
19
103
20
14
17.5
29
19
44
21
59
20
74
18
89
19
104
16
15
19
30
22
45
21
60
20
75
22
90
19
105
17
样品名称
C-1-0
1
CAW-45-AG-1-0
7
CAW-45-AG-SNP-1-0
13
C-2-0
2
CAW-45-AG-2-0
8
CAW-45-AG-SNP-2-0
14
C-3-0
3
CAW-45-AG-3-0
9
CAW-45-AG-SNP-3-0
15
CAW-45-1-0
4
CAW-45-SNP-1-0
10
CAW-45-2-0
5
CAW-45-SNP-2-0
11
CAW-45-3-0
6
CAW-45-SNP-3-0
12
2天取样（2008-09-23-08：
00——2008-10-03-08：
00）
2008-09-23
2008-09-25
2008-09-27
2008-09-29
2008-10-01
2008-10-03
名
称
体
积
名称
体
积
名
称
体积
名称
体积
名
称
体积
名称
体积
1
18.5
16
19.5
31
20
46
21
61
21
76
24.5
2
21
17
19.5
32
21
47
20
62
23
77
25.5
3
22
18
20
33
17.5
48
21
63
21
78
25
4
20
19
20.5
34
19.5
49
22.5
64
21
79
26
5
21
20
18.5
35
20
50
20
65
21
80
26
6
18
21
19
36
20
51
20
66
19.5
81
26
7
21
22
19
37
20.5
52
19
67
21
82
26
8
20
23
20
38
18.5
53
21
68
22
83
25
9
19
24
20
39
18
54
21
69
22
84
24
10
19
25
19
40
19
55
21
70
20
85
25
11
19
26
19.5
41
19.5
56
21.5
71
23
86
25
12
18
27
19.5
42
21
57
21
72
20
87
25
13
21
28
18
43
22
58
21
73
20
88
25
14
15
29
20.5
44
24
59
21
74
20
89
25
15
22.5
30
22.5
45
23.5
60
21
75
24
90
24
第四部分：
实验方法
一：
生物量的检测
1：
每次取样时记录取样体积，取样后将菌丝体过虑另存。
2：
将菌丝体依照提取方法加入相应试剂，匀浆后超声破碎，记录破碎后体积。
3：
剪出圆形滤纸片并称出质量，吸取1毫升破碎后的固液混合物过滤并干燥，再称出质量
4：
计算菌丝体生物量。
单位g/L
二：
Folin-Ciocalteu显色剂的配制
[参考文献]【ShelaG,MarinaZ,RatipornH.Comparativecontentoftotalpolyphenolsanddietaryfiberintropicalfruitsandpersimmon[J].JournalofNutritionalBiochemistry,1999,
10（6）:
367~371.】
【SilvinaBL,BalzF.Relevanceofapplepolyphenolsasantioxidantsinhumanplasma:
Contrastinginvitroandinvivoeffects[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2004,
36
（2）:
201~211.】
【曹炜,索志荣.Folin-Ciocalteu比色法测定蜂蜜中总酚酸的含量[J].食品与发酵工业,2003,29（12）:
80~82.】
在1000mL的磨口回流装置内加入50g钨酸钠（Na2WO4）,12.5g钼酸钠（Na2Mo4）,350mL三蒸水（dH2O）,25mL浓磷酸及50mL浓盐酸,充分混匀,以小火回流10h（此时电压约为70伏）,再加入75g硫酸锂（Li2SO4）,25mL蒸馏水,数滴溴水。
然后开口继续沸腾15min,使得溴水完全挥发为止,冷却后定容至500mL,过滤,滤液呈绿色,置于棕色试剂瓶中保存,使用时加入1倍体积的蒸馏水,使酸的浓度为1mol/L,此液为应用液,置于冰箱中可以长期保存。
摘自：
Folin-Ciocalteu比色法测定蜂蜜中总酚酸的含量
使用的相关仪器：
1000mL的磨口回流装置（即磨口烧瓶）；1000mL的量筒；100ml的量筒；500ml的容量瓶；500ml洁净的棕色玻璃瓶。
使用的相关化学药品：
50g钨酸钠（Na2WO4）；12.5g钼酸钠（Na2Mo4）；350mL三蒸水（dH2O）；25mL浓磷酸；50mL浓盐酸；75g硫酸锂（Li2SO4）；25mL蒸馏水；数滴溴水。
具体的操作步骤：
分别称取50g钨酸钠（Na2WO4）；12.5g钼酸钠（Na2Mo4）；分别量取350mL三蒸水（dH2O），25mL浓磷酸，50mL浓盐酸；在1000mL的磨口回流装置内加入50g钨酸钠（Na2WO4）,12.5g钼酸钠（Na2Mo4）；再加入350mL三蒸水（dH2O）,25mL浓磷酸及50mL浓盐酸,充分混匀；以小火回流10h（此时电压约为70伏）；称量并加入75g硫酸锂（Li2SO4）,25mL蒸馏水,数滴溴水；然后开口继续沸腾15min,使得溴水完全挥发为止；冷却后定容至500mL；过滤,滤液呈绿色,置于棕色试剂瓶中保存。
注意事项：
使用时加入1倍体积的蒸馏水,使酸的浓度为1mol/L。
；此液为应用液,置于冰箱中可以长期保存
三：
胞内多酚含量测定方法
[参考文献]【ShelaG,MarinaZ,RatipornH.Comparativecontentoftotalpolyphenolsanddietaryfiberintropicalfruitsandpersimmon[J].JournalofNutritionalBiochemistry,1999,
10（6）:
367~371.】
【SilvinaBL,BalzF.Relevanceofapplepolyphenolsasantioxidantsinhumanplasma:
Contrastinginvitroandinvivoeffects[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2004,
36
（2）:
201~211.】
【曹炜,索志荣.Folin-Ciocalteu比色法测定蜂蜜中总酚酸的含量[J].食品与发酵工业,2003,29（12）:
80~82.】
1：
确定桦褐孔菌菌丝体生物量：
方法见上述
2：
提取胞内酚类化合物：
将菌丝体加入80%乙醇在冰浴中匀浆后超声提取3次。
3：
胞内多酚含量的测定：
向试管中分别加入相应的液体混合物0.5毫升。
加入Folin-Ciocalteu显色剂0.3毫升。
震荡，闭光7至8分钟以后再加入10%的Na2CO3溶液1.2毫升。
闭光放置1小时后，再加入3毫升三蒸水，然后在765纳米处测定吸光度值并记录。
四：
胞外多酚含量测定方法
[参考文献]【ShelaG,MarinaZ,RatipornH.Comparativecontentoftotalpolyphenolsanddietaryfiberintropicalfruitsandpersimmon[J].JournalofNutritionalBiochemistry,1999,
10（6）:
367~371.】
【SilvinaBL,BalzF.Relevanceofapplepolyphenolsasantioxidantsinhumanplasma:
Contrastinginvitroandinvivoeffects[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2004,
36
（2）:
201~211.】
【曹炜,索志荣.Folin-Ciocalteu比色法测定蜂蜜中总酚酸的含量[J].食品与发酵工业,2003,29（12）:
80~82.】
向试管中分别加入相应的培养液0.5毫升。
加入Folin-Ciocalteu显色剂0.3毫升。
震荡，闭光7至8分钟以后再加入10%的Na2CO3溶液1.2毫升。
闭光放置1小时后，再加入3毫升三蒸水，然后在765纳米处测定吸光度值。
五：
对超氧阴离子自由基清除能力的测定方法
[参考文献]【AndrewJ.Kirby,RichardJ.Schmidt.TheantioxidantactivityofChineseherbsforeczemaandofplaceboherbs–I[J].JournalofEthnopharmacology,1997,56:
103~108.】
一：
试剂配制（如果浓度过大会影响测试结果，可以分梯度做预实验）
：
配制0.05摩尔每升PH=8.2的Tris-HCl缓冲溶液200毫升。
Tris的质量=0.1*100*0.001*121.14=1211.4毫克，加入0.1mol/L的盐酸45.8毫升再加水到200毫升并用广范PH试纸测得PH=8.2。
：
3mmol/L的邻苯三酚10毫升：
3*0.001*10*0.001*126.11*1000=3.7833毫克（分子式:
C6H6O3分子量:
126.11沸点:
309℃熔点:
131-135℃）。
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8mol/L的盐酸。
二：
操作步骤
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加入1.5mlpH=8.2的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，再加入0.5ml蒸馏水（空白对照管）或样品的胞内丙酮提取物（样品管-0.1毫升样品加入到0.4毫升的水中）。
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混匀后于25℃水浴20min。
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取出后立即加入0.3ml25℃预热的3mmol/L的邻苯三酚（溶于水）。
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用蒸馏水调零（2.3毫升），于420nm处测得A空和A样。
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清除率=（A空—A样）/A空×100%。
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贴标签：
共77只小试管（含蒸馏水管）。
六：
DPPH自由基清除能力的测定
[参考文献]【Shcherba,V.V.,Babitskaia,V.G.,Kurchenko,V.P.,Ikonnikova,N.V.andKu
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