鸡大肠杆菌血清型鉴定和药敏试验.docx
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鸡大肠杆菌血清型鉴定和药敏试验
鸡大肠杆菌血清型鉴定与药敏试验
（新科学院生物工程系生物技术091班）
绪论
鸡大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌（avianpathgenicityE．coli，APEC）引起的急性或慢性细菌性传染病。
本病目前呈世界性分布，国内各地的鸡群普遍存在感染并常有发病。
该病的特征是病型多，包括急性败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、眼炎、关节炎、脐炎、肉芽肿以及肺炎等，最常见的为气囊炎、输卵管炎[1,2]。
在临床上往往不单独发病，一般继发于一些病毒性感染如新城疫、马立克氏病、传染性支气管炎等。
现有的研究表明，APEC抗原性复杂、血清型多样，不同类型之间和不同地区之间致病菌的血清型差别很大[3]。
鸡大肠杆菌病一年四季均可发生，各品种和各年龄的鸡均可感染，若不及时采取有效的防治措施，便会导致大量死亡。
大肠杆菌易产生耐药性，用药物控制该病不但费用高、效果不佳，且会造成药物残留和降低产品品质，为此，有效防治该病就显得尤为重要。
本研究对新乡地区某鸡群发生的疑似鸡大肠杆菌病进行了初步诊断，并采集典型病料进行病原菌的血清型鉴定和药敏试验，取得了理想效果，为该病的确切诊断和有效防治提供了可靠依据。
现将有关情况报告如下：
1材料与方法
1.1病料来源
对来自新乡市一养鸡厂疑似鸡大肠杆菌病的病例进行临床初步诊断[4]，病鸡表现为精神委顿，羽毛松乱，食欲废绝，拉黄白稀粪。
用灭菌棉接触采集病鸡粪便作为病料。
（材料由动科学院提供）
1.2主要试剂
草酸铵结晶紫（天津市博迪化工有限公司）
碘液、氯化钠（北京中联化工试剂厂）
牛肉浸粉、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限公司）
95%酒精（天津市天力化学试剂有限公司）
番红（天津市瑞金特化学品有限公司）
葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖等微量发酵管（杭州天河微生物试剂有限公司）
葡萄糖、乳糖、猪胆盐、中性红（郑州派尼化工试剂厂）
营养琼脂（上海光星生物技术有限公司）
甲基红试剂、吲哚试剂、VP指示剂（天津市瑞金特化学品有限公司）
磷酸氢二钾、生理盐水、伊红、美兰、石碳酸、乙醚（广西汕头市西龙化工厂）
标准麦氏比浊管（北京红娃数字机电技术有限公司）
1.3培养基
营养肉汤培养基麦康凯培养基伊红美兰培养基蛋白胨水营养琼脂培养基
1.3.1培养基的制备[5]
营养肉汤培养基
蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml
称取蛋白胨5g，量取蒸馏水1000ml，将牛肉浸粉倒入，边加热边搅拌，沸腾后停止加热，调pH至7.0-7.4，分装到试管中，加塞后在压力为0.11Mpa，温度为121℃条件下灭菌15分钟。
备用。
麦康凯培养基
蛋白胨20g,乳糖10g,猪胆盐5g,氯化钠5g，0.5%中性红水溶液5mL，0.01%结晶紫水溶液10mL，琼脂17g，蒸馏水1000ml
将蛋白胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。
将琼脂加入600mL蒸馏水中加热溶解。
将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min。
备用。
临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。
伊红美兰培养基
蛋白胨10g,乳糖10g,磷酸氢二钾2g,琼脂20g，2%伊红水溶液20ml,0.5%美蓝水溶液13ml,蒸馏水1000ml
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调整pH为7.2-7.4，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min。
备用。
临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
蛋白胨水
蛋白胨20g,氯化钠5g，葡萄糖，蒸馏水1000ml
依次称取蛋白胨，氯化钠与烧杯中，加入蒸馏水，调节pH至7.4。
分装小试管，121℃高压灭菌15min。
备用。
（葡萄糖蛋白胨水溶液（每100mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g））。
营养琼脂培养基
牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂20g、NaCl5g、蒸馏水1000ml
依次将牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl，溶于1000ml蒸馏水中，调节pH至7.4，分装，121℃高压蒸汽灭菌15min。
备用。
1.4大肠杆菌诊断血清
O1（批号200904），O2（批号200901），O5（批号200605），O8（批号200901），O9（批号200901），O11（批号200904），O14（批号200211），O15（批号200709），O18（批号200408），O19（批号200709），O20（批号200407），O21（批号200901），O24（批号200709），O26（批号200709），O35（批号200901），O36（批号200505），O50（批号200505），O54（批号200709），O74（批号200211），O78（批号200612），O88（批号200901），O119（批号200104），O141（批号200901），O147（批号200803），O157（批号200901），E.coli标准抗“O”血清。
以上均购自中国兽医药品监察所，均在有效期内。
4℃保存备用。
1.5药敏纸片
罗红霉素（批号：
100531），庆大霉素（批号：
1001201），阿米卡星（批号：
1010221），米诺环素（批号：
1010132），阿奇霉素（批号：
101213）,复方新诺明（批号：
1009031），四环素（批号：
1008311），头孢唑啉（批号：
100901），头孢曲松（批号：
1009252）和氧氟沙星（批号：
1009022），均由北京天坛药物生物技术开发公司生产。
以上药敏纸片均购自河南省生物所。
1.6主要仪器
显微镜（AC220VIN重庆光电仪器总公司）
恒温培养箱（PYX-DHS-50X65-BS-II上海跃进医疗器械厂）
灭菌锅（YMSI-280B宁波市镇海金鑫医疗器械有限公司）
恒温干燥箱（DHP-9082上海一恒科学仪器有限公司）
离心机（HUI-34JK重庆天达仪器厂）
电冰箱（BS/BD-231H新飞集团）
超净工作台（SW-CJ-IC苏净集团安泰公司）
1.7方法
1.7.1细菌分离培养
用接种环无菌操作从病料中挑取病原菌，并接种于普通营养肉汤中进行增殖培养，37℃培养24h。
然后在无菌条件下将病料接种到麦康凯培养基上，在培养箱中37℃培养24h。
挑取砖红色单个菌落接种到伊红美蓝培养基上，37℃培养24h。
观察符合大肠杆菌生长特性，在伊红美蓝培养基上连续培养3次，做成纯培养物。
1.7.2抹片染色镜检
从伊红美蓝培养基上挑取可疑单个菌落进行抹片、革兰氏染色和油镜观察细菌形态排列及染色特性，镜检后将可疑单个菌落的剩余部分接于普通肉汤培养基中培养。
染色方法按照文献要求进行[6]。
1、涂片固定：
取多个玻片，用滴管滴一滴蒸馏水在玻片中央，用烧红冷却的接种环轻轻在培养基中划取，并涂布均匀一薄层，涂片面积不宜过大，手持载玻片的一端，在酒精灯外焰处来回划几次，并不时的用载玻片背面触及皮肤，不觉过烫为宜，且不可紧靠火焰或加热时间过长。
放置冷却后，进行染色。
2、初染：
在涂片薄膜上滴草酸铵结晶紫染液1-2滴，染色约1分钟。
3、水洗：
斜置载玻片，在自来水下水流冲洗，直到留下的水呈无色为止。
4、媒染：
吸取碘液涂在玻片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1分钟。
5、水洗：
斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至留下的水呈无色为止，用吸水纸吸取水分。
6、脱色：
斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，直至留下的乙醇不呈现紫色为止，时间20-30s,立即用缓缓冲洗，注意脱色时间不可过长，以免出现假阴性。
7、复染：
在涂片薄膜上滴加番红染液1-2滴，染色约1分钟，水洗，干燥。
8、镜检：
将玻片放于显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴香波油，用油镜观察细菌的形态和染色结果。
镜检可见染色均一，形态短小的革兰氏阴性菌。
符合大肠杆菌形态特征。
将疑似鸡大肠杆菌单菌落在营养肉汤培养基上进行扩大培养。
1.7.3生化试验
参照文献[7,8,9]进行以下各项生化试验。
糖类发酵管试验
取纯培养的病菌接种于糖类（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖）微量发酵管中，37℃培养24h，观察结果。
吲哚试验：
取纯培养的病菌接种于蛋白胨水培养液中，37℃培养2d。
先加入少量乙醚，摇动试管以萃取和浓缩吲哚，待乙醚浮于培养液表面后，再沿试管壁徐徐加入吲哚试剂数滴，观察结果。
甲基红（M-R）试验：
取纯培养的病菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养液中，37℃培养2d，加入甲基红试剂两滴，立即观察结果。
V-P试验：
取纯培养的病菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养液中，37℃培养2d，加入等量的V-P试剂（先加入V-P甲液，再加入V-P乙液），混匀后，观察结果。
在糖类发酵管试验中，若细菌能分解此种糖类产酸，则指示剂呈酸性变化，发酵管中颜色发生改变；不分解此种糖类，则无颜色变化；产气可使倒置的小管内出现气泡。
吲哚试验中，在接触面呈红色者即为阳性反应。
甲基红（M-R）试验中，红色者为阳性，黄色者为阴性。
在V-P试验中，呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。
1.7.4血清学试验
1.7.4.1“O”抗原的制备
将纯培养的被检菌于营养琼脂培养基上密集划线，37℃培养24h。
以4ml0.5%石碳酸生理盐水洗下以后以2000r/min离心5min。
之后，上悬液8000r/min，离心10min，然后沉淀物配成菌悬液。
经121℃2h处理，破坏k抗原。
即为“O”抗原，4℃保存备用。
1.7.4.2“O”抗原浓度的确定
1、轻摇标准麦氏比浊管管。
2、无菌操作将被测定的菌悬液加到与标准管相同直径（大小）的无菌试管中。
3、无菌操作向被测定试管加入无菌蒸馏水，直到浓度与所要求的标准管的浓度（6亿菌/mL）相同，共得到6mL。
1.7.4.3“O”因子血清的稀释
以“O”因子血清所标的效价。
用0.5%石碳酸生理盐水分别做8倍稀释。
置4℃冰箱备用。
1.7.4.4菌株“O”抗原的鉴定
取洁净玻片，中间用线划开分为左右两部分，并注明相应血清型标号。
分别将一滴稀释过的血清滴于左侧，再将一滴生理盐水滴于玻片右侧。
之后滴加等量被检菌“O”抗原于两侧附近。
用火柴棒将之混匀,观察结果。
同时做标准菌株阳性对照。
此方法制备的凝集抗原即为大肠杆菌“O”抗原。
分离菌株的血清型鉴定参照参考文献[10,11]所述方法进行。
用25种大肠杆菌单因子血清，对该大肠杆菌“O”抗原进行平板凝集试验。
判定：
3min内出现凝集者为阳性反应，否则判定为阴性。
1.7.5药敏试验
采用平板表面散布法。
1、将分离菌株的肉汤纯培养物均匀地涂抹于事先准备好的营养琼脂平板上。
2、将各种药敏片贴于营养琼脂培养基上。
3、贴好纸片的平板于37℃倒置培养18h。
观察和测量药敏试验的抑菌圈直径，记录结果。
分离菌株对各种药物的敏感性判定标准按有关文献进行[12,13]。
高敏：
抑菌圈直径大于20mm；中敏：
抑菌圈直径为15-20mm；低敏：
抑菌圈直径小于15mm。
2结果
2.1分离培养特性
采集病料经分离培养所得到的细菌在各种培养基中的培养特性如下：
普通营养肉汤24h培养物,强混浊度，有菌膜有菌环，试管底部有粘稠絮状沉淀（如图1）；在麦康凯平板上均生长为表面光滑、边缘整齐、钝圆形、隆起的红色菌落（如图2）；伊红美蓝琼脂平板上均生长为圆形、隆起、边缘整齐、表面光滑，黑色并有金属光泽的小菌落（如图3）。
根据该株细菌的上述培养特性，初步判定其为鸡大肠杆菌。
空白对照大肠杆菌
图1图2
肉汤培养基麦康凯培养基
图3
伊红美蓝培养基
2.2细菌形态及染色特征
挑取该分离菌株的单个典型菌落，进行革兰氏染色镜检。
结果可见到1-2mm,两端钝圆，散在或成对存在的卵圆形或短杆状得红色细菌，如图4（标准菌），如图5（实验菌）。
根据该株细菌的上述染色形态特征，进一步判定其为鸡大肠杆菌。
图4图5
鸡大肠杆菌（标准菌）的细菌形态分离菌细胞形态
2.3生化试验结果
所分离菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、MR、吲哚试验均呈阳性；V-P试验呈阴性。
该分离菌株符合大肠杆菌的生化反应特性。
如图6,7,8。
详情见表1。
表1鸡大肠杆菌生化试验检测结果
Table1BiochemistryTestsResultofIsolatedE.coliStrains
菌株名称
StrainNames
葡萄糖
乳糖
麦芽糖
蔗糖
MR
吲哚
VP
鸡大肠杆菌
⊕
⊕
⊕
⊕
+
+
-
注:
“+”为产酸；“–”为不分解；“⊕”为产酸产气。
Note:
“+”meansacid-producing;“–”meansnegativereaction;“⊕”meansacid-producingandgas-forming.
对照组菌株（阳性）对照组（阳性）菌株对照阳性阴性
图6（甲基红）图7（吲哚试验）图8（VP试验）
根据细菌形态染色特性，结合分离培养及生化特性鉴定结果，判定该分离到的菌株为鸡大肠杆菌。
2.4血清学试验结果见表2。
表2分离菌株血清学试验结果
Table2ResultsofSerologicalTests
菌株名称
StrainName
O1
O2
O5
O8
O9
O11
O14
O15
O18
O19
O20
O21
O24
O26
O35
O36
O50
O54
O74
O78
O88
O
119
O141
O147
O157
致病菌株
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
注:
“+”为凝集；“–”为不凝集。
Note:
“+”meansagglutination;“–”meansnoagglutination.
玻片上的O1血清与试菌液发生了凝集。
表明该致病大肠杆菌的血清型为O1。
2.5药敏试验结果
试验结果的判定标准依据有关文献[12,13]报道的国家卫生部制定的标准进行判定：
经检测，该鸡大肠杆菌对10种药物呈现出不同程度的药物敏感性。
该株鸡大肠杆菌对复方新诺明、头孢唑啉、头孢曲松、氧氟沙星均敏感，对阿米卡星、庆大霉素和阿奇霉素为中度敏感；但对罗红霉素、米诺环素和四环素耐药。
详见表3。
图10药敏试验结果
表3分离菌株药敏试验结果
Table3ResultsofAntibioticSensitivityTest
单位；d=mm
抗菌药名称
Names
分离菌株
Strain
药物敏感性
DrugSensitivity
罗红霉素
0
耐药
庆大霉素
16
中度敏感
阿米卡星
18
中度敏感
米诺环素
1
耐药
阿奇霉素
16
中度敏感
复方新诺明
23
敏感
四环素
1
耐药
头孢曲松
28
敏感
头孢唑啉
27
敏感
氧氟沙星
24
敏感
3讨论
本研究对新乡地区某发病鸡群的病料进行了细菌分离鉴定，结果判定为O1型大肠杆菌，且毒力较强。
药敏试验结果表明，该菌株对不同的药物敏感性存在一定的差异，但总体来说，对其敏感的药物较多。
本地区应更加注重“防”，一旦发生该病，虽可用药物很多，但该地区菌株毒力强，仍可造成惨重损失。
因此，对于鸡大肠杆菌病所造成的损失和影响，应引起大家的重视，采取有效措施进行综合防制。
血清学试验鉴定出为01型血清。
此结果与王丽荣[14]等报道的豫北地区大肠杆菌主要血清型为01、02、078、0111的结果相符。
由于大肠杆菌在鸡舍、鸡体消化道广泛存在，且不同发病鸡场的大肠杆菌血清型可能不同及同一血清型的不同菌株在不同鸡场所表现的致病性也有差异[15]，因此必须进行致病性试验，确定分离菌株致病性的强弱，然后选择具有致病性的分离株研制针对不同发病鸡场的疫苗，进行免疫接种，才有可能有效预防不同发病鸡场的大肠杆菌病。
目前，随着抗生素的泛滥应用，E．coli的耐药菌株口益增多，从表3看出．10种抗菌药物中，对大肠杆菌抑制作用最强的是头孢曲松和头孢唑啉。
大肠杆菌对四环素、阿米卡星、庆大霉素、阿奇霉素耐药性已相当普遍，已开始失去其应用价值，这也就是目前禽大肠杆菌病难以控制的原因之。
第3代头孢类抗生素如头孢曲松在兽医临床上应用较少，因此分离菌对此具有很高的敏感性，但人医临床目前已广泛使用，如在肉禽生产中广泛应用，将会导致肉禽产品中的第3代头孢类抗生素药残对人体内革兰氏阴性菌产生耐药性，有关革兰氏阴性菌对它们的耐药性报导[16]在逐年增多，由此看来单纯依靠抗菌药物控制禽大肠杆菌病，这场人与细菌之间的战争难以平息。
因此，必须寻求其他防制大肠杆菌病的办法，如加强生物安全措施，改善养殖环境，使用微生态制剂对致病性E．coli竞争性抑制及用新型疫苗进行（E．coli外膜蛋白或E．coli菌毛疫苗）免疫防制等。
结论
通过以上试验和分析可知该分离菌为致病性鸡大肠杆菌，血清型为01。
镜检观察该细菌有许多不同的形态，短杆状居多。
在以上各个培养基上生长和各项生化试验均符合大肠杆菌特征。
本地区病原对复方新诺明、头孢曲松、头孢唑啉、氧氟沙星均敏感，对阿米卡星、庆大霉素和阿奇霉素为中度敏感；但对罗红霉素、米诺环素和四环素耐药。
综上所述，本研究试验结果对疑似鸡大肠杆菌病进行了确切的诊断，并为有效防治该病提出了科学的依据和有利条件，为制作抗鸡大肠杆菌“O”抗原疫苗的进一步研究奠定了基础。
对指导养殖生产具有重要意义和应用价值。
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致谢
本试验研究是在指导老师的悉心指导下完成的，期间老师等给予了大力支持和帮助。
同时也感谢我们组的成员，在试验的过程中孟杰同学给予我很大的帮助，谢谢你们陪我走过这段有意义的时光。
在大学即将毕业之际，更深刻的感受到同学的温暖，老师的呵护。
所有学校的领导以及我的同学在此表示衷心感谢！
同时感谢动物科学学院对这次毕业设计提供的试验材料等支持，感谢动科学院老师在试验过程中的指导与帮助！
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