最详细：crispr-cas9系统原理应用及发展.ppt
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CRISPR-Cas9系统基因修饰理论与实战,1基因表达研究方法,干扰基因表达（过表达或低表达），或者表达突变体并检测其相关生理功能，是基因功能研究中最重要的方式之一；基因表达技术-质粒转染，病毒转染等传统方法得到广泛运用，但同时其也存在缺点；,1基因修饰的方法与各自优势,质粒-瞬时转染-某些细胞效率偏低-表达结果不稳定，有内源表达的干扰；质粒-稳定细胞-表达结果不稳定，筛选效率不高，在重组插入基因组中可能干扰其它基因表达；病毒-瞬时感染-表达结果不稳定，质粒容易在细胞复制过程中丢失，随机插入基因组中可能会干扰其它基因表达；新一代的基因编辑技术-利用重组酶在基因组水平修饰基因，产生的遗传性质稳定，直接作用于内源，减少表达干扰，目前有成熟的技术如CRISPR/Cas9；,DNA,NHEJandHDR,DNA修复的机制与基因编辑原理,非同源性末端接合修复机制（Non-homologousendjoining,NHEJ）,同源介导的修复机制（Homology-directedrepair,HDR）,5,ZFNandTALEN,ZFN与TALEN基因编辑原理,6,LeC,FAnnR,DavidC,etal.2013,Science,（6121）:
819-823.,GenomeEditinginMammalianCells,7,Dumpiernematodes,Zebrafishembryos,Fruitflies,PennisiE.2013.Science,（6148）:
833-6.,Rice,ModelsgeneratedbyCRISPR/Cas9system,Monkey,1CRISPR-Cas概述,1987年，日本大阪大学（OsakaUniversity）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。
2013以后，研究者们在包括science和naturebiotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。
1CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas：
一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
识别,切割,1CRISPR-Cas概述,1.1CRISPR结构,CRISPR：
（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。
CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列（repeats）组成,重复序列的长度通常2148bp,重复序列之间被2672bp间隔序列（spacer）隔开。
CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。
1.1CRISPR结构,1.2Cas家族,Cas（CRISPRassociated）：
存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。
它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
2CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。
2CRISPR-Cas系统的发现,2CRISPR-Cas系统的发现,2CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。
在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。
这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。
2CRISPR-Cas系统靶向要求,最主要的要求：
PAM（protospacer-adjacentmotif）为NGG。
2CRISPR-Cas系统靶向要求,在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGGPAM。
2CRISPR-Cas系统靶向要求,3CRISPR-Cas系统介导基因修饰,3.1dual-RNA：
Cas介导编辑模板替换,2013年1月29日在naturebiotechnology上发表的RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。
3.1dual-RNA：
Cas介导编辑模板替换,3.2sg-RNA：
Cas介导基因修饰,2013年1月29日在naturebiotechnology上发表的efficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。
3.2sg-RNA：
Cas介导基因修饰,3.2sg-RNA：
Cas介导基因修饰,3.2sg-RNA：
Cas介导基因修饰,Cas9,sg-RNA,2013年2月15日在science上发表的MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。
3.3cr-RNA：
Cas介导双基因修饰,3.3cr-RNA：
Cas介导双基因修饰,4CRISPR-Cas系统前景分析,这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。
4CRISPR-Cas系统前景分析,2013年4月12日在cellstemcell上发表的EnhancedEfficiencyofHumanPluripotentStemCellGenomeEditingthroughReplacingTALENswithCRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。
4CRISPR-Cas系统前景分析,而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。
4CRISPR-Cas,只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。
编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。
较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。
技术优势,5我们的工作利用CRISPR-Cas9载体肿瘤基因M在卵巢癌细胞HeLa的编辑与敲除,流程-a.sgRNA的引物设计（4条）；b.px459-cas9载体构建，HeLa细胞上的转染与基因靶点筛选（1次）；c.母克隆的基因剪切的确定（2-3个母克隆）；d.单克隆筛选（2-3轮，100个子克隆）f.单克隆的鉴定（Q-PCR以及WB检测）；,母克隆8-31-M测序,子克隆8-31-12-d-M测序,5我们的结果成功获得了M基因敲除的HeLa细胞系，,模板CCCGGCAGGCTGGACAC-TTCGTGGAGGGCTCCAAAG11-5-1CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG（缺失2个碱基，移码）11-5-2CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG（缺失6个碱基，不移码）11-5-3CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG（缺失6个碱基，不移码）11-5-5CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG（缺失2个碱基，移码）11-5-4CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG（缺失2个碱基，移码）11-5-6CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG（缺失2个碱基，移码）11-18-1CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG（缺失2个碱基，移码）11-18-2CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG（缺失2个碱基，移码）11-18-4CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG（插入1碱基，移码）11-18-6CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG（缺失2个碱基，移码）11-18-8CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG（缺失2个碱基，移码）11-18-9CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG（缺失6个碱基，不移码）11-18-5CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG（插入1碱基，移码）11-18-7CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG（插入1碱基，移码）,5我们的结果验证肿瘤增殖、迁移等功能受到影响；,
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