胶体金技术.docx
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胶体金技术
一、胶体金的一般性状
（一）胶体金的颜色
溶胶的颜色取决于分散相物质的颜色、分散相物质的分散度和入射光线的种类，是散射光线还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短。
对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，呈现的颜色亦不同。
如胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红色的葡萄酒色；20～40nm之间的金溶胶主要吸收波长530nm的绿色光，溶液呈深红色；60nm的胶体金溶胶主要吸收波长600nm的橙黄色光，溶液呈蓝紫色。
一般应用于免疫组织化学的胶体金颗粒为5～60nm范围内，溶液呈现红色。
在相当的一段时期内保持其溶胶不变性，称为胶体金的稳定性。
影响其稳定性的因素主要是电解质，其次是胶体金本身的浓度、温度及其他非电解质等。
（二）胶体金的稳定性
溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散相之间，其颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。
然而，溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总面积较大、因在胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。
当胶体颗粒直径变大，超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。
影响其稳定性的主要原因有三点。
（1）胶粒间的相互吸引力当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶体颗粒合并而变大。
（2）胶粒及其溶剂化层胶粒及其溶剂化层（溶剂是水时就是水化层）的带电情况。
一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。
同性电荷相斥，双电子层变厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。
（3）胶体接口的溶剂膜当二个固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。
两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。
（三）溶胶的聚沉现象
胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶胶粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。
因为某种原因使溶胶粒带电量减到很小，甚至中和其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。
引起溶胶聚沉的原因有。
（1）少量电解质对溶胶的聚沉作用少量电解质即可使溶胶聚沉，但各种电解质的聚沉能力可用聚沉值来表示。
聚沉值是在一定时间内使1L某浓度的溶胶产生聚沉所需电解质的最小物质的量（mm01）。
显然，聚沉值愈小，聚沉能力愈大。
聚沉值从实验中得出如下的规则：
①电解质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用；②同价离子聚沉能力几乎相等，不同价离子的聚沉能力随离子价增加而显著增加。
电解质能使溶胶聚沉是由于电解质与胶粒带相反电荷离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电子层厚度缩至很小和溶剂化层变得很薄时，两个质粒间便可以更加接近，即不产生斥力，两个胶粒间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉。
胶粒的双电子层结构图
（2）温度对溶胶稳定性的影响一般影响不大。
当温度升高时，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加。
（3）浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉，所以制备比较稳定的溶胶，要有一定的合适浓度。
二、胶体金制备前的准备
制备胶体金的方法很多，其中应用较为广泛的是还原法，而分散法和其他凝聚法都不合乎要求。
还原法的基本原理是在氯化金溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。
在医学研究中最常用的还原剂有白磷、乙醇、过氧化氢、抗坏血酸、硼氢化钠、柠檬酸钠及鞣酸等。
本节将重点介绍应用上述还原剂制备胶体金的具体方法和步骤，还可根据各实验室的条件及所需合成颗粒的大小，来选择合适的方法。
现将常用的几种方法介绍如下：
①白磷还原法（Isigmondy，1905年）可合成3nm左右大小的金颗粒；②白磷还原法（1sigmondy及IsigmondyThiessen，1925年）经改良后，可合成5～12nm大小的金颗粒；③抗坏血酸还原法（Statis和Fabrikanos，1958年）可合成6～13nm大小的金颗粒；④柠檬酸三钠还原法（Frens，1973年）可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金颗粒；⑤乙醇—超声波还原法（Baigent和Muller，1980年）可合成6～10nm大小的金颗粒；⑥硼氢化钠还原法（Trchopp等，1982年）可合成3—17nm大小的金颗粒；⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法（Slot等，1985年）可合成3～17nm大小的金颗粒。
作者实验室主要用单宁酸—柠檬酸三钠还原法、柠檬酸三钠还原法及硼氢化钠还原法，主要根据合成颗粒大小来选择。
（一）玻璃器皿的清洁
还原法可以认为是重结晶过程，颗粒的大小取决于结晶核形成的速度及结晶核生长的速度。
因此，用于制备胶体金的玻璃器皿应绝对清洁。
因为玻璃表面性状对还原过程的启动有重要作用，少量的污染会影响胶体金的生成，造成颗粒大小不一或液体浑浊。
处理方法是将玻璃器皿清洁晾干后，人清洁液内浸泡24h，取出后依次用自来水和蒸馏水洗净，凉干，硅化，也可不经硅化。
第一次生成胶体金稳定玻璃器皿表面，然后弃去，再用蒸馏水洗后即可再用。
最好是所有的玻璃器皿专用化，以减少污染。
玻璃器皿表面应无明显的划痕，否则也会影响胶体颗粒的均一度。
（二）试剂的配制要求
（1）配制试剂均用双蒸馏水或三蒸馏水，或用去离子水。
（2）氯化金水溶液的配制氯金酸（AuCl3·HCl）每支为1g装，用时用蒸馏水一次全部稀释成l％水溶液，呈现黄色的透明状，应无任何沉淀，未用完部分可保存在4℃冰箱内，长期使用。
（3）SPA纯晶、特异性抗体或第二抗体必须经亲和层析，琼脂免疫双扩散效价为1：
64以上才可选用，其他蛋白及受体也需高度纯化。
（4）白磷或黄磷乙醚溶液的配制白磷在空气中易燃烧，操作时要小心。
把白磷放在蒸馏水中切成小块，放在滤纸上吸干水分后，迅速放入已准备好的乙醚中，轻轻摇动，等完全溶解后即得到饱和溶液，并贮藏于棕色密闭瓶内，阴凉处保存。
（5）其他试剂配制后最好用一定规格的超滤膜过滤，以去除大分子聚合物。
三、白磷还原法制备胶体金分散颗粒
胶体金可用多种方法制备，其中应用较为广泛的是化学还原法。
这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子，可用于制备胶体金的还原剂有50余种，但在生物医学领域内最为常用的还原剂是白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸等。
白磷还原法的建立已有近百年的历史，由于此法操作较为简便，制备出来的胶体金颗粒大小较一致，因而应用较为广泛，现以Faulk和Taylor（1971）的报道为基础介绍这一方法。
（1）取1％氯化金1.5mL、0.1mol／LK2CO31.2mL，加入120mL双蒸水。
（2）上述溶液充分搅拌混匀3min以上。
（3）在搅拌条件下将lmL新鲜配制的20％饱和白磷乙醚溶液加入上述混合液中，约在5min内溶液变为棕红色。
（4）将上述混合液加热煮沸，直至变成鲜明的橙红色为止，一般约需l0min。
橙红色的出现表明氯化金的还原反应终止，胶体金制备成功。
按上述法制备的金颗粒直径为（5.6土0.9）nm。
白磷还原法一般只能制备出单一颗粒直径的胶体金。
因此，用于电镜双重标记或多重标记时此法显得有些不足，还需结合其他方法。
Henegouwen等（1986）发展了传统的白磷还原法，可制备出多种不同直径的胶体金，取得了良好的效果，具体方法如下。
（1）取0.5mL新鲜配制的20％饱和白磷乙醚溶液，加入到60mL用上述方法制备的胶体金中（5.6nm土0.9nm）充分振摇5min以上。
（2）将1％氯化金0.75m1及0.1mol／LK2C030.6mL加到上述溶液内，振摇数分钟溶液变成棕红色。
（3）将上液煮沸加热，直至变成鲜明的红色，一般需l0min。
上述还原过程使胶体金颗粒直径增大，随着还原次数的增加，胶体金颗粒的直径亦越来越大，二者之间的关系见表。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系（白磷还原法）
还原次数
颗粒直径/nm
SD
0
16
0.9
1
6.7
0.9
2
7.9
0.9
4
9.8
1.3
5
12
1.0
这一方法的特点是通过循环还原的引入使原白磷还原法的适用范围得到扩大，其次，在循环还原过程中氯化金不再形成新的金颗粒，而只与原先的金颗粒结合，使它直径变大。
原先加人的胶体金颗粒起着“晶核”的作用。
因此可以利用这一方法制备出一系列颗粒直径不同但具有相同颗粒密度的胶体金来。
四、柠檬酸钠还原法制备胶体金分散颗粒
柠檬酸钠还原法（Frens，1973）制备过程十分简单，制备出的金颗粒均匀一致，因此广为采用。
取0．01％氯化金溶液l00mL加热至沸腾，迅速加入4mL1％柠檬酸钠水溶液，可见溶液很快变蓝，然后继续加热至溶液由蓝变为橙红色为止。
通过改变柠檬酸钠的用量可以制得不同颗粒大小的胶体金，因而显得十分方便。
各种颗粒的胶体金制备详见表。
柠檬酸钠用量与胶体金颗粒直径的关系
0.0l%氯化金用量/m
1%柠檬酸钠用量/mL
胶体金颗粒直径/nm
50
2.00
10.0
50
1.50
15.0
50
1.00
16.0
50
0.75
24.5
50
0.50
41.0
50
0.30
71.5
50
0.21
97.5
50
0.16
147.0
表并不表明按照Frens法只能制备出上述几种颗粒的胶体金，大量研究已表明该法制备胶体金时，颗粒的大小是柠檬酸钠用量的函数，即在一定的范围内任意给定一个柠檬酸钠的量，总有一定大小的胶体金颗粒与它相对应，因而这种方法可很好地满足电镜双重标记和多重标记的要求。
五、制备胶体金分散颗粒的其他方法
（一）乙醇—超声波还原法（Baigent和Muller，1980）
（1）取1％AuCl3·HCl水溶液lmL加入100mL双重蒸馏水。
（2）用0.2m01/LK2C03调pH至7.2，再加入lmL无水乙醇。
（3）用20KC、135W超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，此法制备的颗粒为6-10nm。
硼氢化钠还原法（Tschopp等，1982）
（1）取0.6mL1％氯化金水溶液，加入40mL预冷（4℃）双蒸馏水。
（2）再加入0.2mol/LK2C030．2mL。
（3）边搅拌边加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液（0.5mg/m1）2mL，至溶液由蓝紫色变为橙红色为止。
然后继续搅拌5min，获得的金颗粒直径在2-5nm之间。
（二）放射性胶体金制备法（Kent等，1981）
（1）取0.01％AuCl3·HCl水溶液100mL，加热至沸腾。
（2）加入40ul195Au。
（3）迅速加入4mLl％柠檬酸三钠水溶液，搅拌5-7min，至出现透明的橙红色。
（4）其含量为脉冲数1×10s/min。
六、胶体金的质量鉴定
胶体金制备好后，应进行颗粒直径的测定及金颗粒间大小的均匀度鉴定。
1．胶体金颗粒直径测定
用预先处理好的覆有Formvar膜的300目镍网浸入胶体金溶液内，取出放在空气中干燥或37℃烤干。
于透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度，计算平均直径。
如电镜放大10万倍，照片放大2.5倍，则10万×2.5＝250000＝25nm。
理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。
2．胶体金颗粒均匀度的测定
一般需测量100个以上的胶体金颗粒，然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差。
3．影响胶体金颗粒大小的因素
如果总数超过10％以上大小不等的金颗粒及椭圆形、三角形金颗粒存在，应重新制备。
其原因如下：
①还原剂不是一次快速加入；
②容器太大或太小，及在100℃加温时间超过15min；
③在室温或4℃保存太久；
④低温保存。
七、待胶体金标记蛋白质的准备
（一）原理
蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，根据电荷正负相吸的原理；被吸收附于胶体金颗粒表面，使其牢固结合，一般胶体金颗粒表面带负电，与蛋白质所带的正电荷基团间靠静电引力作用相结合。
另外，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使标记蛋白质的金探针较为稳定。
（二）待胶体金标记蛋白质的准备
1．透析除盐
蛋白质在提取和纯化过程中会保留一部分盐类成分，但用于胶体金标记的蛋白质应尽量降低电介质的成分，因此，在用前必须将多余的电介质除去。
因为过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位，影响蛋白质的吸附。
方法：
将待标记的蛋白质装入透析袋中，用蒸馏水或低浓度的盐水（0.005mol/LNaCl，pH7.0）透析2h。
2．去除聚合的蛋白质
对于长期低温保存的蛋白质，特别是浓度超过2mg/mL，很容易形成聚合物，这些聚合物可影响标记效率及胶体金探针的稳定性，因此在标记前应离心除去，用时以100000g于4℃离心1h即可。
调整蛋白质浓度至lmg/mL即可用于标记。
八、胶体金pH值的调整
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点（pI）略偏碱的条件下，二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至标记蛋白质的等电点略偏碱。
一般可用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl调高或调低pH值。
由于金溶胶会损害pH计探头，故采用pH试纸测定pH值。
几种常用的蛋白质标记时，胶体金所用pH值见表。
胶体金合成中各种蛋白、酶的等电点
蛋白
pH
IgG
9.0
F（ab）2
7.2
McAb
8.2
SPA
5.7-6.2
HRP
7.2-8.0
BSA
5.2-5.5
胰岛素—BSA结合物
0.6
亲和层析IgG
7.6
大豆凝集素
6.1
DNA酶
6.0
RNA酶
9.0-9.2
低密度脂蛋白
5.5
亲和素
10.0-10.6
链霉亲和素
6.4-6.8
凝集素（Lectin）I
8.0
α—球蛋白
6.0
霍乱毒素
6.9
破伤风毒素
6.9
九、确定胶体金与待标记蛋白质用量
（一）目测法
将待标记的蛋白质逐级稀释后，以5～40ug各取等体积顺序加入一系列装有lmL胶体金的试管中，另设一不加蛋白的对照管，混匀。
5min后，再于上述各管中分别加入0.1mL10％NaCl溶液，混匀后，静置20min，观察结果。
未加蛋白质和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的试管，呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白质量达到最低稳定量的试管则保持红色不变。
其中蛋白质最低的试管即含稳定lmL胶体金的必需蛋白质量。
·在此基础上再加10％，即为稳定蛋白质的实际用量[设X＝加入蛋白质量，X十（XXl0％）＝每毫升胶体金需加蛋白量），见图或加入BSA使其最终浓度为5％。
胶体金待标记蛋白质用量比例测定图标
用于测定颗粒直径为5nm的胶体金标记蛋白质的用量，测定时必须在每毫升金溶液中加入30％H20210mL，用0.lm01/LK2CO3调pH至待标记蛋白质的等电点，再加入蛋白质溶液（5-40/ag）和100ul10％NaCl，5min后观察结果，不出现蓝色絮状物的试管即是足以稳定胶体金的蛋白质量。
一般羊抗兔IgG适量为27ug/mL胶体金溶液，葡萄球菌A蛋白适量为15ug/mL胶体金溶液。
（二）光电比色法
制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1m1），分别加入5mL胶体金，迅速混匀，各加入lmL10％NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管OD值。
根据胶体金颗粒大小，决定OD值波长，一般在520～580nm之间，测完后，绘制曲线图，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横纵标作一曲线，取曲线最先与横轴水免疫组织化学实验技术及应用平的那一点为蛋白质用量最稳定量。
图中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为40ug/mL。
表为用0.01％氯化金酸制备的每毫升金溶胶中，不同颗粒直径和吸收波长之间的关系，可知其每毫升胶体金溶液中所含胶体金颗粒数和吸收光波数值。
用0.01％氯化金酸制备的每毫升金溶胶中不同颗粒大小、颗粒数和它们吸收波长之间的关系
颗粒直径/nm
颗粒数/个
OD520
颗粒数（OD520＝1）/个
4.5
6.3×1012
0.85
7.5×1013
10.0
5.7×1012
0.97
5.9×1013
19.0
7.7×101l
1.1l
7.0×1011
30.0
2.0×1010
1.18
1.7×1011
41.5
8.0×1010
1.12
7.2×1010
十、蛋白质的胶体金标记
当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后，便可进行标记。
具体步骤如下。
（1）根据标记所用胶体金的总量计算出所需要待标记蛋白质的总量。
（2）边搅拌边将蛋白质溶液加入胶体金溶液中，逐渐加入，lmg的蛋白质量大约需5min，或在搅拌下将胶体金逐渐加入到蛋白质溶液中，大约需5～10min。
（3）继续搅拌10min，然后加入5％BSA使其终浓度为1％，或加入3％聚乙二醇（PEG，Mr：
20000）使其终浓度为0．05％，其效果BSA要优于PEG。
（4）将标记好的胶体金装入透析袋中，两头扎紧，放人蔗糖或硅胶中浓缩，浓缩到原体积的1/10量，浓缩完毕后纯化。
如用离心纯化方法时，不需要浓缩。
十一、胶体金标记蛋白质的纯化
标记好的免疫金探针必须经过纯化处理才能用于IHC染色，尤其是免疫电镜的染色。
纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。
其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。
（一）超迷离心法
根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同，离心的转速和时间也不同。
用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG，可先从低速离心（20nm颗粒用250g；5nm用4800g20min），弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀，然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心1h，20nm和40nm金标记物用14000g于4℃离心1h。
小心地吸出上清，将管底沉淀再用1％牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量，平衡过夜后，重复离心2次，最后一次洗涤离心的沉淀，再用1％牛血清白蛋白缓冲液（含0.02mol/LNaN3）稀释到l：
20。
40nm金颗粒在520nm检验吸光度为0.35；20nm金颗粒为0.30；5nm金颗粒为0.25，用1％牛血清白蛋白缓冲液作空白。
制备的胶体金—蛋白探针可保存于4℃，如加入50％甘油可贮于0℃以下（-18℃）1年以上。
以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金，按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同，用不同离心转速分离纯化，以白磷还原法制备的5.0nm胶体金A蛋白，用125000×g离心；抗坏血酸法制备的11.3nm胶体金—A蛋白，用150000g离心45min，可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀，其上为较疏松的红色沉积物，再上为透明的上清液。
附贴管底的沉淀无用，以后操作步骤中不要搅起来，仍保持其贴于管底。
弃去上清液后，用等体积的0.0lmol/LPBS（pH7.2）溶解疏松红色沉积物，同上重复离心1次，小心移去上清液，剩余0.5mL上清液，将疏松红色沉积物溶解后，即为初步提纯的金标—A蛋白试剂。
（二）凝胶过滤法
凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。
将前述胶体金—蛋白质复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液，以15000r/min离心15min（或用上述离心法纯化后的胶体金，再进一步用此方法纯化）。
吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400（SephacrylS-400，Pharmacia公司产品，Sweden）色谱柱上分离纯化。
柱床高20cm，直径0.8cm，加样体积为柱床体积的1/10。
用0.02mol/LTBS液（内含0.1％BSA，0.05mol/LNaN3，pH8.2者用于胶体金标记IgG，pH7.0者用于胶体金标记蛋白A）洗脱，流速为8mL/h，按红色深浅分管收集洗脱液。
可见先滤出的液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质。
纯化的金标记蛋白滤出液随浓度增加而红色逐渐加深，清亮透明，此后为略呈黄色的未标记蛋白组分。
表中列出胶体金与蛋白质结合后，用离心法纯化的条件。
表中列出几种免疫金探针离心纯化的条件，仅供参考。
超迷离心转速与金颗粒直径的关系
颗粒直径/nm
离心力/g
2-3
125000
4-5
120000
6-8
100000
10-15
64000
15~20
14000
几种免疫金探针离心纯化条件
胶体金颗粒/nm
pH
标记蛋白质
离心力/g
时间/min
5
9.0
羊抗人IgG
45000
45
10
8.2
McAb
45000
30
15
6.5
链霉亲和素
120000
45
20
6.0
SPA
120000
30
10
9.0
羊抗兔IgG
120000
60
十二、胶体金探针的质量鉴定
1．金颗粒的大小及均匀度
用有Formvar支持膜的镍网蘸取金标记试剂，空气干燥后，透射电镜下观察金颗粒的大小及均匀度，计算平均直径，如电镜放大倍数10万，照片放大为2.5倍，100000×2.5＝250000＝25nm。
空气中干燥后乙酸铀负染，在透射电镜下观察，可见金颗粒周围有一明显的空晕，表示颗粒表面吸附着蛋白质分子。
支持膜（火棉胶膜）的制备；50mil5％的火棉胶+50mi乙酸戊酯，戊酯火棉胶。
2．用免疫细胞化学滤纸模型鉴定免疫金制剂的特异性和敏感性制得2.5％的乙酸
在WhatmamI号滤纸条上滴加2//l的抗原溶液（含抗原量分别为1ug、l00ng、10ng、3ng和lng），干燥后，纸条在甲醛蒸气中固定。
加适当稀释的抗体作用1h，用TBS（0.05mol/LpH7.4Tris缓冲液，含．15mol/LNaCl），1％TritonX-l00洗3次，每次10min。
随后，纸条再用洗脱SephacrylS-400柱的相同洗脱缓冲液洗10min，再滴加不同稀释度的金标探针孵育1h。
纸条再用TBS-Triton缓冲液洗3次，每次10min。
用TBS（不含TritonX-100）洗10min。
再用双蒸水洗3次各5min。
用银显影液显影30-40min。
用双蒸水洗终止显影。
也可用下法试验金探针：
将系列稀释的1：
100、1；200、l；500、1：
1000和l：
10000的正常兔血清2/11分别滴加在滤纸条上，然后用甲醛蒸气固定，纸片再用适当稀释的羊抗兔IgG金探针在室温中孵育1h，洗涤，再按上述方法用银显影。
这方法可以初步测定金探针的质量，也可用于一些抗原分析研究。
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