BDFACSCalibur流式细胞仪简单操作技巧步骤.docx
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BDFACSCalibur流式细胞仪简单操作技巧步骤
BDFACSCalibur流式细胞仪
简易操作步骤
-、开机
1）先打开净化交流稳压电源，其次打开110V稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机。
2）向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色
箭头所示）方向调在VENT位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN位置。
:
■、开启CellQuest软件、编辑实验文件
1）在屏幕下方点击CELLQuest（第四个图标）文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），
启动软件。
桌面会出现一'Untitled实验将实验文件窗口放大。
电子版本：
流式细胞仪\BDFACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤
corrZYH20140520
2）从工具板中点击散点图图示。
在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。
出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。
PlotSource，选择AcquisitionandAnalysis（收取、
3）在出现的散点图对话方框中点击
分析），确认X和Y轴参数预设为FSC-H1024、SSC-H1024
4）从屏幕上方Plots菜单中选择DotPlot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的
对话方框内选择X轴：
FL1-H1024;如果是双标，Y轴选择：
FL2-H1024（根据实验检
测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明），如果是单标，Y轴选择：
SSC-H。
点击OK，FL1/FL2的散点图出现。
完成后可将重制图移至原图右方。
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说明：
散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立
参数的相互关系。
在图中，横坐标X轴和纵坐标Y轴参数分别设为FSC-H1024、SSC-H
1024;双荧光标记时，第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H1024、FL2-H1024，X轴为
为荧光1强度的相对值，单位是道数，Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。
仪
器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数。
修改动作为轻击图谱上X和Y轴参
数，并依需要选择之（FSC:
细胞大小，SSC:
细胞折射率，FL1:
FITC绿色荧光，
FL2:
PE橙色荧光，FL3:
PerCP红色荧光）。
5）在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动
Quadrant的中心将它设定在（x,y）=（101,101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。
6）从工具板中点击直方图图示，在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然
后放开鼠标。
单色荧光只需一个直方图，和第二个散点图一样，横坐标选择FL-1，纵
坐标默认为Counts;若是双色荧光，需画2个直方图，一个横坐标选择FL-1-1024,
另一个横坐标选择FL-2-1024;
7）在上面直方图中画出M1和M2，其中M1代表隐性数目（一般标示是101）,M2代表
阳性数目（除M1以外所有的部分）。
8）从Stats菜单中选择QuadrantStats
（象限统计）,5）步骤中的点图将分为四个象限。
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三、建立仪器和计算机之间通讯
从Acquire菜单中选择ConnecttoCytometer（快捷键Win+b），此时会出现AcquisitionControl对话方框。
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Status
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QFL3-H
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四、仪器设置文件
注意：
实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。
仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。
仪器设定文件（Instrument
settings），含信号器高压（Detector/Amps），阈值（Threshold），荧光补偿
（Compensation）等仪器条件的组合。
一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps-
Threshold--Compensation。
1）检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。
出现Detectors/Amps窗口。
在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC（根据实验样品确定，一般细胞选择LIN，细菌选择LOG），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。
2）从Cytometer菜单中选择Threshold，出现Threshold窗口在Threshold窗口：
确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。
将其拖至空白区。
3）从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。
将其拖至空白区。
五、上样品、设置仪器
使仪器处于HighRUN，样品管支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。
确认
AcquisitionControl窗口中Setup前需打叉或打勾（即不储存数据，用于仪器设置），
点击Acquire。
1、调节FSC/SSC探测器（电压）
观察FSC/SSC图的变化。
FSC电压（Voltage）预设为E00，可调节AmpGain从1.00—
9.99使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1;较小细胞，将
FSC电压设置于E01）。
调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。
调节FSC/SSC图的
原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现
象。
调整定位后，点击AcquisitionControl窗口中的Pause。
arrow
QODerectors/Amps
slidercontrol
gFourColorOCX"rmFL2|:
1
2、Gating圈选
细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。
我们常用前方散射（FSC）与侧方
散射（SSC）的二维位图，即散射光图谱（ScatterPlot），来圈选出不同细胞群的范围，
选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。
1）在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1区域（如
下图）。
分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的
细胞。
如果要删除R1区域，您可以在工具列中点选Gates宀Regionlist，以鼠标点
选R1，再按Delete键删除R1区域。
删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。
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ssc
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FSC
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常CI
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2）选取希望Gate的FL1/FL2散点图，从
Plots菜单中选择Formatdotplot。
在出现的对
话方框内，将NoGate改选G仁R1。
点击OK。
OIn&pe口。
匚DocPlot
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XParametefpl2SG
YParj"^terp22S&
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ShawTitle
AruJystsDellol
EventCdor
MultiColorGatm|
3、调节FL1、FL2的探测器（电压）
1）点击AcquisitionControl窗口中的Restart。
在Detector/Amps窗口中调节FL1、FL2
的电压，使NegativeControl细胞群着落在所选直方图或散点图之100--101处。
a
I-1-M
Idi1
cfxLynr^hps
2）在Threshold窗口，适当地提高要切掉主要细胞族群。
FSC阈值＞52，以去除碎片或低阶噪音。
唯需注意不
AcamsiionDotPlat
）200
如QCOOQOO
FSC-H
1000
OSL§§0导02
干2留
3）点击AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。
移去阴性对照管，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光，不要再改动Detector/Amps、Threshold等数值。
4、调节荧光补偿
说明：
最适化的最后一步是调节光谱重迭。
（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是2色
样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1、
FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿）。
口:
:
:
:
:
Compeiksation：
：
：
：
：
：
U
1）HighRUN，换上单染CD3-FITC管。
点击Acquisition
Control窗口中的Acquire。
调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞
在FL1/FL2散点图的右下象限。
补偿调节可通过点击来选
择或直接拖动滑标上下移动。
调节完毕，点击Acquisition
Control窗口中的Pause。
FLI-nz-
FL2-
FL3-
FL刍-fL4-
FL2rLIFL5
FIL2
F-L4
FL3
2）移去单染CD3，换上单染CD1
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