Western.docx
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Western
WesternBlotProtocol（仅供参考）
一、提取抗原蛋白
将提取RNA途中留存的样品，加入150μl100%酒精充分混匀，静置5min（RT）,2000×g,4℃离心5min,吸取上清至新管中,加入750μl异丙醇,混匀,静置10min（RT）,12000×g,4℃离心10min,弃上清,加入1mlL盐酸胍/95%酒精重悬沉淀,用加样器打散沉淀,混旋20~30秒,静置20min（RT）,7500×g,4℃离心5min,弃上清,从头加入1mlL盐酸胍/95%酒精两次,重悬沉淀,离心后弃上清,加入100%无水乙醇1ml,混旋1min,静置20min（RT）,7500×g,4℃离心5min,弃上清,真空干燥5min,50μl1%SDS溶解沉淀，用50℃热水助溶，直至全数溶解。
10000×g,离心10min,去除沉渣。
二、蛋白定量
1. 取PBS、各样品10ul，加DW990ul
2. 取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度ml。
3. 向各管加入mlD试剂（A50ml＋＋A－2%Na2CO3、NaOH，B－%CuSO4，C－1%酒石酸钠）混匀，静置10分钟。
4. 迅速加入酚试剂，混匀37℃水浴30分钟。
5. 721分光光度计650nm，比色，S0标准管调零。
6. 最后稀释为4ug/ul，加载样缓冲液后，终浓度为2ug/ul，上样量为30～80ug/泳道。
三、电泳
1. makegel．
11%分离胶12ml两块胶
4%积层胶6ml两块胶
DWml
DW堵漏
3MTrisml
Trisml
30%Arcml
30%Arcmlml
10%SDSml
10%SDS60ul
10%APSml
10%APS20ul30ul
TEMED10ul
TEMED5ul6ul
2.上样前样品处置：
样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30S。
3.通电电：
积层胶电泳电压50V左右，分离胶电泳电压90～110V。
4. 考马斯亮蓝染色：
1小时，1号脱色1小时，2号脱色2小时。
四、电转印
1. 将滤纸NcM切成与凝胶尺寸大小，置于DM中渗透5分钟，电转液平稳15分钟。
2. 转移：
用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将NcM、胶夹于中间，在NcM与大滤纸之间垫小滤纸。
NcM朝正极，20V恒压转移12小时。
取下NcM杂交，凝胶染色看成效。
五、杂交
1. 取下NcM，做好标记，dH2O冲洗，室温滤纸干或放入膜固定液15分钟。
2. NcM用PBS冲洗二遍，呈5～6%non－fatmilk的的PBS中封锁，室温６－８小时或室温1－2小时，4℃，留宿。
3. 将封锁的膜用ＰＢＳ冲洗一遍，洗15分钟×1，5分钟×2。
4. 加入一抗11000－1200，室温，反映1小时
5. PBS洗15分钟×1，15分钟×4。
6. 加入二抗15000，室温，反映1小时。
7. PBS洗15分钟×1，5分钟×4。
六、化学发光试剂检测
1. 混合等体积Bottle1&2与NcM共孵育1分钟。
2. 放射自显影：
曝光3分钟至10分钟。
3. 显影后清水漂洗，再定影。
七、所用试剂
1、匀浆缓冲液4×1L：
NaH2PO4（·H2O）
Na2PO4·12H2O
NaCl
dw800ml,adjustpHto,adjustVolto1L
（1）历时稀释4倍。
（2）40mlPBS＋PMSF40ul＋phenautehroline80ul＋Iodo80ul＋pepstalmA80ul
2.系列牛血清蛋白浓度稀释法：
取500ug/mlBSA按下法配制：
500ug/mlBSA
NS
蛋白浓度ug/ml
S1
50ul
ml
S2
100ul
ml
25
S3
200ul
ml
50
S4
400ul
ml
100
S5
800ul
ml
200
3.30%Acrylamide
单丙、双丙溶解于60mlDDW，调Vol到100ml
4.3MTris－HclbufferpH100ml.
称Tris溶于水到100ml，调pH到
5.MTris－HclbufferpH100ml
称溶解后，调pH到，调体积到100ml
6.Samplesbuffer10ml
10%SDS
2ml
甘油
1ml
Tris
ml
用前按9加溴酚兰、%DTT贮备液。
DDW
ml
7.电转液1LpH－
Glycine
g
Trisbase
g
dH2O
800ml
Methanol
200ml
10%SDS
2ml
8.pHPBS2L
NaCl
KCl
Na2HPO4
（）
NaH2PO4
（）
加DW到2L
9.10×电极缓冲液400mlpH
Trisbase
g
甘氨酸
g
加DW400ml,调，用前加%
10.脱色液1号
甲醇
250ml
冰醋酸
50ml
＋DW到500ml
11.脱色液2号
甲醇
100ml
冰醋酸
75ml
＋DW到1000ml
WesternBlot详解
Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部份的抗体检测。
该文要紧通过以下几个方面来详细地介绍一下WesternBlot技术。
（1） 原理
（2） 分类
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
（3） 主要试剂
（4） 主要程序
（5） 实验常见的问题指南
1. 参考书推荐
2. 针对样品的常见问题
3. 抗体
4. 滤纸、胶和膜的问题
5. Marker的相关疑问
6. 染色的选择
7. 参照的疑问
8. 缓冲液配方的常见问题
9. 条件的摸索
10. 方法的介绍
11. 结果分析
1） 原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2） 分类
western显色的方法主要有以下几种：
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：
反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
（3） 要紧试剂
1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热（以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和1%（w/v）N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
）储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:
10%（w/v），1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、 分离胶缓冲液:
LTris-HCL:
和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C保存。
4、 浓缩胶缓冲液:
LTris-HCL:
溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
10%（w/v）过硫酸胺溶液。
提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.
6、 SDS-PAGE加样缓冲液:
LTris缓冲液8ml，甘油，10%SDS，巯基乙醇，%溴酚蓝，H2O32ml混匀备用。
按1:
1或1:
2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:
，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得LL甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释10倍。
8、 转移缓冲液：
配制1L转移缓冲液，需称取甘氨酸、碱、SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、 丽春红染液储存液：
丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。
使用后应予以废弃。
10、 脱脂奶粉5%（w/v）。
11、 NaN3%叠氮钠（有毒，戴手套操作），溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）。
12、 Tris缓冲盐溶液（TBS）:
20mmol/LTris/HCL，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20（15）鼠抗人-MMP-9（16）鼠抗人-TIMP-1。
14、 过氧化物酶标记的第二抗体。
15、 NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。
16、 BCIP（溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。
17、 100mmol/LTris-HCL。
18、 100mmol/LNaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL，5mmol/LEDTA。
（可以参看分子克隆）
（4） 要紧程序
在这主要列举了一些网站上的有关WesternBlot的英文资料，读者可以根据自己实验室的实际情况进行调整：
WesternBlotPROTOCOL：
（5） 实验常见的问题指南
根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！
）：
1. 参考书推荐
A. 对初学者看什么资料比较好？
解答：
《抗体技术实验指南》和Antibodies（alaboratorymanual，wrotebyEdHarlow，davidlane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题
B. 做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot（以下简写成WesternBlot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，此刻愈来愈差，上样量已加到120μg，换了个santacloz的一抗仍不行。
是什么缘故？
蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
解答：
怀疑是样品问题，可能是：
1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。
同时，建议检查WesternBlot过程，提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
C. 细胞水平要做WesternBlot，多少细胞提的蛋白够WesternBlot？
解答：
一般地5*106就足够了。
D. 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，如此对WesternBlot有无阻碍?
解答：
能，没有问题，我们做过。
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？
解答：
当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F. 若是目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：
如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，可是在转膜时常常会发觉只有一部份蛋白转到了膜上，确实是在转膜后染胶发觉有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么方法能够解决？
解答：
你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大适合？
积层胶的浓度又该用多少？
这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？
解答：
260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，StackingGel％。
I. 若是上样量超载，要用什么方式来增加上样量？
若是需要加大上样量使原先弱的条带能看清楚。
解答：
可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载30％是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试的comb。
J. 蛋白变性后能够寄存多久？
解答：
－80℃，一两年没有问题。
最关键两条：
不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
K. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采纳%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采纳11％的配方，不知为何？
解答：
上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
L. 接下来我预备采纳DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采纳如此的方案后，封锁液是不是要作调整，可否再用5％的脱脂奶粉呢？
仿佛有资料说脱脂奶粉会阻碍亲和素生物素的生成，是吗？
解答：
不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
M. 还有一问题，一样一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：
WesternBlot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。
开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。
要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。
所以拿到好的结果不容易。
N. 做组织样品的western的时候，处置样品有什么窍门吗？
还有，您用过大牛血清做封锁剂吗？
浓度如何？
成效是不是比BSA好一点？
解答：
必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。
还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。
如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
O. 您是不是能够介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：
做200kd蛋白的WesternBlot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
P. 有什么方式能够提高上样量？
解答：
可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
Q. 我要检测的目的蛋白是分子量可能为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不能够不用到超速离心机，有无直接用低温高速离心机就能够够的提到膜蛋白的方式，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：
如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripabuffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做WesternBlot就可以了。
如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。
42kd不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
R. 蛋白的上样量有无什么具体的要求？
解答：
上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过μg/mm2。
S. 一抗，二抗的比例是不是重要？
解答：
比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
3. 抗体
T. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WesternBlot，其二抗有何要求？
解答：
对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
U. 同一公司的另外抗体用那个稀释度做出来成效专门好，因此没做预试，怕费时刻，用什么样的稀释度比较好呢？
我用的ELL+plus试剂盒显色。
转膜留宿，一抗孵育也是留宿的，假设封锁也留宿的话就要四天才看的到结果了。
解答：
不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。
我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。
至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。
一抗当然可以过夜，如果你想所短WesternBlot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。
至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：
1500；二抗1：
20000试试。
另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！
V. 免疫组化和WesternBlot能够用同一种抗体吗？
解答：
免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。
如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。
（限于单抗）
W. WesternBlot中抗体的重复应用问题
解答：
抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。
稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
4. 滤纸、胶和膜的问题
X. NC膜\PVDF膜\尼龙膜如何辨别？
解答：
尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：
尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
就温度适应性而言：
尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：
尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：
尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
Y. 在做WesternBlot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：
PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
Z. 检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK能够在同一张膜上吗？
解答：
可以。
AA. 转膜后经丽春红染色的条带，什么缘故大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是专门好，什么缘故？
解答：
这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。
BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，仍是用上样缓冲液？
解答：
用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。
CC. 采纳tanksystem有什么讲究？
解答：
建议低电压，长时间，（一般tankSystem用衡压好点），如28V14－16hrs。
DD. 做HSPWESTEN定量，一样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？
解答：
这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和IHC。
EE. 膜一样要如何处置？
解答：
一般用甲醇泡泡就可以了。
FF. 若是是6×8转印膜，要加多少一抗？
解答：
一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。
GG. 上下槽缓冲液有何要求，如何才能达到最正确成效。
解答：
无要求。
HH. 跑电泳的时候配的胶老是“缩”是什么缘故呢？
是有的成份不对吗？
解答：
没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。
过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。
如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。
脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。
II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？
解答：
如果是用的是半干转，顺序为：
阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。
滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。
绝对禁忌：
上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。
JJ. 蛋白质的分子量跨度专门大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，能够一次做好吗？
解答：
这么广的分布不好转移，一般建议：
21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge，湿转36V，3－5hrs就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd用7%SDS－page，48V10hrs－16hrs。
KK. 不能专门好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
解答：
可以考虑：
转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）（优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。
太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
LL. 如何选择最适合的蛋白杂交膜？
解答：
蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。
选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。
根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁
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