实验汇总.docx
《实验汇总.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验汇总.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
实验汇总
心之所向，所向披靡
实验汇总
本科生:
1.总糖含量测定（斐林试剂）
1.1步骤
总糖含量的测定包括还原糖和转化糖含量的测定。
还原糖的测定：
用移液管移取提取液10mL，转入100mL锥形瓶，用蒸馏水定容后装入酸式滴定管，然后用移液管移取斐林液A、B各5mL于250mL锥形瓶，摇匀后加蒸馏水约30mL，在电炉上煮至沸腾，继续保持溶液沸腾，用样品液滴至蓝色大部分褪去后加2滴亚甲基蓝，继续滴至溶液转为砖红色，记录样品液滴定值（mL），重复3次。
转化糖的测定：
用移液管取提取液10mL，转入100mL锥形瓶，加6mol/L的HCL5mL，于沸水浴上水解15分钟，溶液冷却后，用NaOH中和（先用6mol/L的NaOH约5mL，再滴加0.56mol/L的NaOH），滴入2滴酚酞指示，加NaOH至溶液显红色即为终点，此为转化糖待测液，定容至100mL，将转化糖装入酸式滴定管，用以滴定斐林液，方法同还原糖测定，记录样品滴定值（mL），重复3次。
1.2结果计算
还原糖（g/100mL）=D*1000/V1,转化糖（g/100mL）=D*1000/V2，蔗糖含量（g/100mL）=（转化糖含量-还原糖含量）*0.95，总糖含量（g/100mL）=还原糖含量+蔗糖含量。
（其中D：
10mL斐林液相当的葡萄糖量g，V1：
还原糖滴定值（mL），V2：
转化糖滴定值（mL））
2.Vc含量测定（2，6-二氯靛酚滴定法）
2.1步骤
用移液管移取提取液5mL，用1%草酸稀释，定容至50mL，用移液管移取稀释液5mL至50mL锥形瓶，通过半微量滴定管滴入2，6-二氯靛酚，直至溶液呈粉红色30秒内不消失，记录2，6-二氯靛酚用量（mL），重复3次。
2.2结果计算
维生素C含量（mg/100mL）=V*A*C*100/B（其中V：
2，6-二氯靛酚用量（mL），A：
每毫升2，6-二氯靛酚相当的维生素C的量，C：
样品稀释倍数，B：
滴定用样品量（mL））
3.Vc含量测定（2，4-二硝基苯肼法）
3.1步骤
称50g鲜样和50mL2%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10～40g匀浆（含1～2mg抗坏血酸）倒入100mL容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。
将稀释液过滤，滤液备用。
不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。
取25mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。
取10mL此氧化提取液，加入10mL2%硫脲溶液，混匀。
于四个试管中各加入4mL稀释液。
一个试管作为空白，在其余三个试管中加入1.0mL2%2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。
3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。
空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0mL2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15min后放入冰水内。
其余步骤同样品。
当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。
将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。
标准曲线绘制：
加2g活性炭于50mL标准溶液中，摇动1min，过滤。
取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度20μg/mL。
取5，10，20，25，40，50，60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10，12μg/mL。
按样品测定步骤形成脎并比色。
以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线。
3.2结果计算
维生素C含量（μg/100g）=C*V*F*100/（W*1000）,C为由回归方程算得“样品稀释液”中抗坏血酸的浓度，μg/mL；V为样品用1%草酸溶液定容的体积，mL；
F为样品氧化过程中的稀释倍数；W为样品重量，g。
4总酸含量测定（酸碱中和滴定）
4.1步骤
用移液管移取提取液5mL，转入100mL锥形瓶，加2滴酚酞，用0.1mol/L的NaOH滴定至溶液出现粉红色不消失为止，记录NaOH用量（mL）,重复3次。
4.2结果计算
总酸含量（g/100mL）=V*N*0.067*100/B（其中V：
NaOH滴定值（mL），N：
NaOH的浓度（mol/L），B：
滴定用样品量（mL），0.067：
苹果酸折算系数）
5叶片中叶绿素含量测定
5.1步骤
称取植物鲜叶0.50g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及80﹪丙酮充分研成匀浆，过滤，滤液入25ml容量瓶中，用80﹪丙酮反复洗涤残渣至滤纸无绿色，合并滤液，定容，摇匀，即得叶绿素提取液。
取上述提取液1ml稀释至10ml，摇匀。
以80%丙酮为参比液，在663，645nm波长下测定吸光度值。
5.2结果计算
Chla含量（mg/g）=（12.7OD663-2.69OD645）×V/W/1000
Chlb含量（mg/g）=（22.9OD645-4.68OD663）×V/W/1000
Chl含量（mg/g）=（20.2OD645+8.02OD663）×V/W/1000
6过氧化物酶的测定（愈伤木酚法）
6.1步骤
称取样品1g，加入20mmol/LKH2PO4溶液5ml，于研钵中研磨成匀浆，在3000r/min下离心10min，上清液转入25ml容量瓶中，残渣再用5mlKH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，定容，混匀，贮于冰箱中备用。
取比色杯2只，于1只中加入已混匀的反应混合液3ml，KH2PO4溶液1ml，作参比液，另一只加入反应混合液3ml，酶液1ml（若浓度过高则需稀释后再加），立即记时并置于分光光度计中，470nm下测定光密度，每隔1min测定一次，连续测30min，每次测定前重新用对照校准。
6.2结果计算
以每minA470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位（u），计算其活力及比活力。
酶活力（0.01A470/min）=（A2-A1）×D×100/（t2-t1），酶的比活力（u/g）=酶活力（u）/样品重。
式中A2-A1：
吸光度的变化；t2-t1：
时间变化（直线部分）D：
稀释倍数，即提取的酶总量为反应系统内酶液的倍数。
U：
酶活力单位
研究生：
1猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定
1.1 SOD提取
取新鲜猪血20ml，加入到檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为0.15：
1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心10min，收集红血球。
然后用2倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心10min，弃上清液；重复2次，得洗净的血红球浓稠液。
然后向洗净的红血球加入等倍体积去蒸馏水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，4 000r/min离心10min，除去变性蛋白沉淀，取清液0.5mL。
过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度），上清液加热到65℃-70℃，保温15min，然后迅速冷却到室温，4000r/min离心5min，弃去沉淀物，收集上清液（样品2记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
粗酶液中加入等量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，冰箱中静置1h，然后4000r/min离心10min，弃去滤液得沉淀。
讲沉淀用丙酮洗两次，离心收集沉淀，自然干燥得绿色成品，称重。
按1mg/1mL溶于蒸馏水，备用。
1.2SOD酶活性测定
（1）邻苯三酚自氧化速率的测定。
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。
要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07。
（2）酶活力测定
样品管取代自氧化管。
样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。
其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。
（3）酶活性单位的计算
酶活性单位活性（u/ml）=（Ao-Am）/（Ao*50%*样液体积）×100%×反应液总体积数×样液稀释倍数样。
其中Ao为邻苯三酚自氧化率；Am为加酶后的邻苯三酚自氧化率。
总活性（U）=单位活性×酶原液总体积
（4）蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝G-250法）
a标准曲线制作：
试剂
试管1
试管2
试管3
试管4
试管5
试管6
蛋白标准液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝（ml）
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量（ug）
0
20
40
60
80
100
盖上塞子，摇匀。
在595nm下闭塞测定光密度值，1h内完成。
以牛血清蛋白（ug）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
b样品中蛋白质含量测定
将待测的SOD溶解病稀释到一定浓度，取一直具塞试管，移液枪加入0.1mL样品提取液，加入0.9mL蒸馏水和考马斯亮蓝试剂，其余操作同上。
c蛋白质含量计算
根据所测吸光度值，在标准曲线上查的相应的蛋白质含量，计算其浓度。
2蛋白质分子量测定（凝胶过滤层析法）
2.1、试剂与器材：
标准蛋白质：
蓝色葡聚糖-2000（200KD）、牛血清清蛋白（67KD）、胃蛋白酶（36KD）、CytC（13.7KD）等，均为分析纯。
洗脱液：
0.2mo·L-1Tris-HCL-KCL,pH7.5。
SephadexG—75（或G—100）。
层析柱：
柱管（1.2*50cm），核酸蛋白检测仪或紫外分光光度计，自动部分收集器，恒压瓶，下口瓶，刻度试管。
2.2操作方法：
（1）凝胶的选择和处理
凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样，流速稳定，结果较好。
如果颗粒大小不匀，用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒。
将称好的干粉倾入过量的洗脱液（一般多用水，盐溶液或缓冲溶液）中，室温下放置，使之充分溶胀。
注意不要过分搅抖，以防颗粒破碎。
溶胀时间因凝胶交联度不同而异为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热将近100℃，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可以杀死细菌和霉菌，并可排除凝胶内气泡。
种类凝胶溶胀时间请查阅葡聚糖凝胶的技术数据表。
（2）装柱
装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气。
装柱方法与一般柱层析法相似。
层析柱可以自制或外购，目前已有各种规格层析柱商品。
装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。
关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。
接着再通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。
新装好的柱要检验其均一性，可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000（又称蓝色右旋糖，商品名为Bluedextran-2000）、红色葡聚糖或细胞色素C等配成2mg/ml的溶液过柱，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。
若层析柱床不均一，必须重新装柱。
（3）加样
要照顾到浓度与粘度两个方面。
分析用量：
1—2ml/100ml柱床容积（1—2%）；制备用量：
20—30ml/100ml柱床容积。
加样方法与一般柱层析相同。
夹紧上、下进、出水口夹子，为防止操作压改变，可将塑料管下口抬高至离柱上端约50cm处（SephadexG-75，选用50cm液柱操作压），打开柱上端的塞子或螺丝帽，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。
沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子。
按加样操作，用1ml洗脱液冲洗管壁2次。
最后加入3—4ml洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。
（4）洗脱
洗脱液应与凝胶溶胀所用液体相同。
洗脱用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。
对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，如水-甲醇、水—乙醇、水-丙酮等为洗脱剂，可以减少吸附，将组分洗下。
本实验洗脱用0.2mo·L-1Tris-HCL-KCL。
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.2mo·L-1Tris-HCL-KCL，以每管3ml/10min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。
影响洗脱液流速的因素有：
①洗脱液加在柱上的压力——操作压（由液面差引起）。
一般来说，流速与柱压力差成正比，但对某些种类凝胶加压不能超过一个极限值，否则加大压力，不仅不能增加流速，反而使流速急剧下降，特别是在使用交联度小（WR＞7.5）的凝胶时要特别注意。
为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。
②凝胶交联度；交联度大的凝胶（G-10至G-50型）的流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。
交联度小的凝胶（G-75至G-200型）的流速与柱的直径有关，并在一定操作压差下有最大的流速值。
③凝胶颗粒大小：
颗粒大时，流速较大，但流速大时洗脱峰形常较宽。
颗粒小时，流速较慢，分离情况较好。
要求在不影响分离效果情况下，尽可能使流速不致太慢，以免用时过长。
（5）重装
一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的“再生”处理，只须在每次层析后用3—4倍柱床体积的洗脱液过柱。
由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装；或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。
有时流速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需竟混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。
（6）凝胶的保存方法
凝胶用完后，可用以下方法保存。
①膨胀状态：
即在水相中保存。
可按注意事项（9），加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。
②半收缩状态：
用完后用水洗净，然后再用60%—70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。
③干燥状态：
用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于60—80℃干燥后保存。
这3种方法中，以干燥状态保存为最好。
2.3标准曲线的制作
层析柱用1.2*100cm，凝胶用SephadexG-75或G-100
将1ml标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025mo·L-1Tris-HCL,pH7.5溶液进行
洗脱。
流速15d/min，2ml/管。
用部分收集器收集，紫外检测仪280nm处检测，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计280nm处测定每管光吸收值。
以管号（或洗脱体积）为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。
根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve）。
然后，以蛋白质分子量的对数1gMr为横坐标，Ve为纵坐标,作出标准曲线。
为了结果可靠，应以同样条件重复1—2次，取Ve的平均值作图。
3Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白
3.1样品的制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
2.材料与试剂：
重组pET-30b（+）-FtFLS质粒、表达宿主菌E.coliBL21（DE3）、固体培养基LB（Kan50μg/mL）、LB液体培养基（10mL、50mL）、Kan（50mg/mL）、IPTG（24mg/mL）、PBS缓冲液、5XSDS上样缓冲液。
仪器与设备：
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip（10μL、200μL、1mL）、微量加样器（10μL、200μL、1mL）、离心管（1.5mL、10mL）。
操作步骤：
①含重组质粒pET-30b（+）-FtFLS的表达宿主菌E.coliBL21（DE3）划线于LB固体培养基（Kan抗性），37℃培养16h。
②挑选单菌落，接种至10mLLB培养基（按0.1%加入Kan，10μL）于37℃过夜培养，即为种子液。
③2%的接种量（1mL）将种子液接种到50mLLBKan培养基中（按0.1%加入Kan，50μL）按，于37℃培养OD600至0.5（约2.5h）。
④加入IPTG至终浓度为1mmol/L（100μL），置于25℃连续诱导表达8h，分别取诱导前0h，诱导后2h、4h、6h和8h的培养液5mL于10mL离心管中，置于冰水混合物上备用。
⑤诱导完毕后，各样品于8000rpm（12000rpm易爆管）离心5min收集沉淀，用等体积PBS（5mL）重悬漂洗细胞2次，收集菌体。
⑥各管分别加入400μLPBS重悬细胞，加入100μL5XSDS上样缓冲液，置于沸水浴中10min（注意防止爆管）。
3.2SDS-PAGESDS-PAGE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）
因为SDS-PAGE上样缓冲液含有SDS和巯基乙醇（2-ME）或二巯基赤藓醇（DTT），其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键、分子内氢键、破坏蛋白质的高级结构、形成SDS-蛋白质复合物。
该复合物形成榛状结构，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，使其带有大量的负电荷（蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖），从而消除了不同分子之间原有的电荷差别。
材料与试剂：
①分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl，0.4%SDS，pH8.8）。
②浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HCl，0.4%SDS，pH6.8）。
③30%丙烯酰胺/N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（Arc/Bis）：
29.2gAcr，0.8gBis，定容至100mL。
④10%过硫酸铵（W/V），需新鲜配制。
⑤2X上样缓冲液（pH8.0）含0.5mol/LTris-HClpH6.8）mL，：
（2甘油2mL，20%SDS2mL（W/V），0.1%溴酚蓝0.5mL，2-β-巯基乙醇（2-ME）1.0mL，定容至10mL。
⑥电极缓冲液（pH8.3）：
3.03gTris，14.41gGly，1.0gSDS，调整pH后定容至1000mL。
⑦染色液：
45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250。
⑧脱色液：
10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。
⑨封底胶：
1g琼脂糖溶于100mL电极缓冲液。
⑩预染标准分子量蛋白质Marker。
仪器与设备：
垂直板电泳槽及其附件，电炉，电泳仪，微量加样器（10μL），Tip（10μL）。
操作步骤：
①电泳槽的安装：
将成套的两块玻璃板正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝（注意分辨上下槽）。
用1%的琼脂糖封底（封于下槽底部），待琼脂糖凝固后即可制胶。
②制胶：
选择合适的胶浓度，按下表配制分离胶，灌入两玻璃板之间，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即覆盖5mm左右水层，静置等待聚合，当分离胶与水层之间的界面重新出现时表明胶已聚合。
小心倒掉分离胶上水层，配制浓缩胶后加入玻璃板中，插入梳子并及时补充由于浓缩胶聚合产生的空隙（该过程避免气泡的产生）。
本实验选用12.5%的SDS-PAGE胶对重组FtFLS进行分离。
试剂
分离胶
浓缩胶
浓度
7.5%
10%
12.5%
15%
30%
4%
分离胶缓冲液mL
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
-
浓缩胶缓冲液mL
-
-
-
-
-
1.25
Acr/BismL
4.0
5.3
6.7
8.0
10.7
0.75
H2OmL
8.0
6.7
5.3
4.0
1.3
3.0
10%APmL
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.15
TEMEDmL
0.008
0.008
0.008
0.008
0.008
0.008
③点样：
分别在上下电泳槽中倒入电极缓冲液，上槽淹没短玻璃板，下槽淹没电极即可。
此时，小心拔出梳子，用微量加样器调整点样孔之间的浓缩胶（此步骤应检查电泳槽是否漏液）。
使用微量进样器分别在样品槽内分别加入预染的标准分子量蛋白质15μL、诱导前0h，诱导2h、4h、6h和8h后处理好的样品7μL（上样总体积一般不超过15μL，加样孔的最大限度可加20μL样品）。
④电泳：
接通电源，调节电压至100V，恒压电泳；待指示剂进入分离胶后，调节电压至200V恒压电泳。
待指示剂在分离胶中迁移5-6cm左右时，停止电泳。
剥胶：
小心剥胶，将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切去（便于识别）。
⑤染色：
凝胶经蒸馏水漂洗1次后加入染色液，电炉加热处理10-20min染色。
⑥脱色：
使用蒸馏水漂洗取出染色液，加入脱色液，电炉加热脱色至出现清晰的蛋白条带。
注意事项：
①上样总体积一般不超过15μL，胶孔的最大限度可加20μL样品。
②微量加样器应贴壁吸取样品，避免吸进气泡；将微量加样器Tip头插至加样孔中缓慢加入样品，避免样品溢出。
③电泳设备应注意检查正负极、是否短路或接触不良、是否漏液、电流电压大小（电流强度会随电泳的进行有所降低）。
④电极缓冲液和AP应新鲜配制，上下槽缓冲液不可混用（电泳完毕分别收集）。
3.3转膜与杂交
杂交膜的选择是决定Westernblotting成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Westernblot的膜主要有两种：
硝酸纤维素膜（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。
大于20kDa的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kDa的蛋白用0.2μm的膜。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5sec。
蛋白质常用的转移方法主要有两种：
槽式湿转和半干转移。
前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
以下为槽式湿转的操作步骤。
材料与试剂：
材料：
PVDF膜，Whatman滤纸，搪瓷盘，一次性PE手套，镊子，玻棒，试剂：
转移缓冲液pH8.3（25mmol/LTris，0.2M甘氨酸，20%甲醇）
升级会员 