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现代生物技术与生物技术药物正文
现代生物技术与生物技术药物
现代生物技术与生物技术药物
第一节 现代生物技术的形成与发展
一、现代生物技术的定义
生物技术又称生物工程，是利用生物有机体（动物、植物和微生物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展各种生物新产品或新工艺的一种技术体系。
生物技术一般包括基因工程（含蛋白质工程），细胞工程，发酵工程和酶工程。
其中以基因工程为核心以及具备基因工程和细胞工程内涵的发酵工程和酶工程才被称为现代生物技术，这样以示与传统的生物技术相区别。
二、现代生物技术的主要内容
基因工程主要包括基因的分离、制备、体外剪切、重组、扩增、表达与产物的纯化技术；细胞工程则包括一切生物类型的基本单位――细胞或器官、组织的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞质、染色体、线粒体和叶绿体等的移植与改建等操作技术；发酵工程也叫微生物工程，是在最适条件下，对单一菌种进行培养，获取某些生物特定产品的一种生物工艺；酶工程是指酶的工业化生产及其固定化技术以及由酶制剂构成的生物反应器和生物传感器等新技术、新装置的研究应用。
现代生物技术的核心内容是重组DNA技术和单克隆抗体技术。
重组DNA技术的操作过程主要包括：
目的基因的获取、基因载体的选择与构建、目的基因与载体的拼接、重组DNA导入受体细胞、筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞、工程菌的大量培养与目的产品蛋白的生产。
生物技术是一种高新技术，在21世纪藉以解决全球人口对粮食和肉类的需求，开发高品质和高产农畜产品；寻求基因诊断和治疗的新方法；确立人体组织器官替代置换新手段；研究开发新药和治疗各种疾病的个性化医药品；环境协调型发展各种生产技术体系；生物处理废弃物及确立环保型农业以解决人类和自然环境协调依存问题。
其意义深远，发展迅速，对国民经济的发展起着重要的作用。
生物技术交叉和渗透到自然科学的各学科形成生物电子学，生物机械学，新生物化学和代谢化学，生物信息学，生物医学及基因治疗学，生物环境治理学及与农业、食品结合发展人工种子和机能性食品等。
正是由于生物技术的强渗透性，使得多学科都向生物技术聚焦，使生物技术焕发了炽烈的活力。
三、生物技术的形成与发展
生物技术的形成经历了三个阶段
1、作坊式：
食品加工、农业、畜牧业；
2、工业化：
发酵工程、发酵工业、抗生素、氨基酸；
3、现代生物技术：
主导技术——基因为源头、基因工程。
生物技术主要建立在分子生物学发展的基础上1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋模型阐明了生物有机体遗传物质的基本结构，开创了分子生物学研究的新纪元。
随后20年的新发现和新突破，为现代生物技术的发展和应用奠定了基础。
1958年，实验证实DNA的半保留复制，提出了中心法则。
1965年，破译了全部遗传密码。
1970年，分离得到了第一个特异切割DNA的限制性内切酶。
1972年，得到了第一个体外重组DNA分子。
1973年，重组质粒成功转入大肠杆菌并得到克隆和表达。
1975年，成功地建立了单克隆抗体。
1982年，世界第一个基因工程产品——人胰岛素上市。
1992年，我国第一个基因工程产品——干扰素α1b上市。
目前生物技术产品的市场每年以大于30％的速度增长，约有60余个生物技术药品上市。
现在正在开发，将在21世纪上市的有近400种。
预计2010年市场可达4000亿美元。
年销售超过亿美元的已有数种，1997年红细胞生成素的世界销售额达15亿美元。
生物技术产品已使全世界2亿人受益。
全球1283家生物技术公司已有300家上市公司，1998年30家赢利，虽然生物技术领域的整体目前仍处于亏损状态，但其股票在升值。
生物技术投入是一般制药业的4倍，属“三高”产业，政府，公司，金融界均对生物技术看好。
第二节 医药生物技术与生物技术药物
医药生物技术主要包括两方面内容；一是利用生物体作为生物反应容器，按人们的意志来研究、生产出医药生物技术产品：
基因工程药物、单克隆抗体、疫苗和寡聚核苷酸及诊断试剂。
二是利用生物技术来改进或创造出新的诊断、治疗、预防疾病的方法：
如基因治疗和生物治疗等。
一、生物药物与生物技术药物的范畴
由于生物技术的崛起和基因工程的发展，提出了生物药物的概念，其包括生化药物、生物制品、微生物药物和生物技术药物等。
随着基因重组药物、基因药物和单克隆抗体的快速发展，生物药物已获得极大的扩充，20世纪70年代后将合成药物、中草药和生物药物并列为我国的三大药源。
生化药物：
是动物、人体、植物、海洋生物等生物体产生的具有强的生理活性的内源性生命基本物质，可经现代生物技术分离成单一的成分和组分，用于疾病的治疗。
生物制品：
20世纪90年代前主要指预防疾病用的疫苗、菌苗、类毒素、抗毒素、血液制品和代谢调节剂等，现在认为基因重组药物也在其中，包括从应用生物技术获得的微生物、细胞、组织和体液等生物材料获得的活性制剂。
微生物药物：
是指微生物在生命活动过程中产生的有生理活性的次级代谢产物及其衍生物，它也经历了几次发展高潮，从开始的天然抗生素到20世纪60年代初的半合成抗生素的研究和应用，以及近年来掀起的从微生物代谢产物中筛选非抗生素类生理活性物质的研究。
其中也运用了很多基因重组技术构建工程菌株。
生物技术药物：
对有些难以规模化生产的微量生命活性物质，经分离纯化研究确证其结构、功效后，利用生物技术的方法进行规模化生产，统称为生物技术药物，也被称为基因工程药物，是重组产品概念在医药领域的扩展应用，指以运用DNA重组技术和单克隆抗体技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子等类药物。
到目前为止，世界各国利用DNA重组技术成功地生产了人胰岛素，人生长激素，生长因子，干扰素、促红细胞生成素等；由此可以看出，生物技术药物与生化药物、微生物药物和生物制品有时并没有很明确的界限。
生物技术药物己具备了作为一大类药物分类的条件。
从来源看，生物药物也可分为四大类型：
①基因重组多肽、蛋白质类治疗剂，即应用重组DNA技术（包括基因工程技术、蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物。
②基因药物，即基因治疗剂、基因疫苗和反义药物等。
③天然生物药物，即来自动物、植物、微生物和海洋生物的天然产物。
④合成与部分合成生物药物。
其中基因重组多肽、蛋白质类治疗剂和基因药物属生物技术药物。
二、生物技术药物的分类
第一代重组药物是一级结构与天然产物完全一致的药物，第二代生物技术药物是应用蛋白质工程技术制造的自然界不存在的新的重组药物。
自1982年第一个重组药物——人胰岛素上市以来，第二代生物技术药物正在取代第一代多肽、蛋白质类替代治疗剂。
1、重组蛋白质和重组多肽药物：
即利用DNA重组技术，将重组对象的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达，最后将表达的目的产物纯化并做成制剂，得到重组多肽、蛋白质类药物。
如细胞因子类药物：
白介素、干扰素等；抗细胞因子药物：
如CD4可溶性受体等；重组溶栓药物：
如重组链激酶，人源化单克隆抗体制剂，重组疫苗和菌苗制剂。
2、重组DNA药物：
基因治疗是指向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片断，以纠正或补偿基因的缺陷；关闭或抑制异常表达的基因；刺激产生相应的抗体，从而达到治疗和预防疾病的目的。
重组DNA药物主要用于基因治疗，包括寡核苷酸药物，反义核苷酸等；基因药物：
腺病毒-IL-2，腺相关病毒-凝血Ⅸ因子等；DNA疫苗：
治疗乙型肝炎、艾滋病的核酸疫苗等。
3、其他生物技术药物：
如微生态制剂，另外还有利用生物技术生产的血液代用品、肿瘤疫苗等等。
三、目前主要的生物技术药物
目前，美国已上市生物技术药物116个，并有723种正在通过FDA审批，还有700多种处于不同研究阶段。
欧美等国已批准的主要生物技术药物有：
重组血液因子：
人重组血液因子组Ⅷ、缺失B结构域的人重组血液因子Ⅷ、人重组血液因子组Ⅸ和重组水蛭素等。
重组人激素：
重组人胰岛素、胰岛素类似物、重组人生长素、重组人高血糖素。
重组干扰素和白介素：
重组IFN-α2a、重组IFN-α、重组IFN-α2b、重组IFN-βlb、重组IL-2和重组IL-11等。
疫苗：
重组HbsAg、含有HbsAg的二联疫苗、含有重组的HbsAg的联合疫苗、含重组HbsAg的联合疫苗和含重组HbsAg的联合疫苗等。
单克隆抗体：
对淋巴瘤CD3的单抗和对TAG-72的单抗等。
其他产品：
促甲状腺素-α，重组TSH，人重组，促卵泡激素-β，重组FSH，促红细胞生长因子和重组EPO，重组β-葡萄糖脑苷酯酶等。
我国已经批准上市的生物技术药物有：
细胞因子类：
白细胞介素2（IL-2）、IL-11；干扰素类（IFN-α1b，IFN-α2a，IFN-α2b、IFN-γ）、红细胞生成素（EPO）、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；生长因子类：
表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和神经生长因子；激素类：
胰岛素、生长激素；酶类：
尿激酶、链激酶、葡激酶；痢疾疫苗；重组乙肝疫苗；抗IL-8单抗乳膏剂，胸苷激酶基因工程细胞制剂等；共20余种。
我国已有生物技术制药企业200多家。
有生产能力的60多家，年产值达40多亿元，正逐年上升，并开始注意产业的群落化与集约化，如生物谷、生物医药城、生物岛等正在逐步建立，力争使生物医药产业成为国民经济的支柱产业。
通过10多年的跟踪研究与创仿相结合的开发阶段，目前我国的生物技术药物研究已开始进入自主创新的时期，并以“新型生物技术药物和疫苗”作为发展重点。
四、生物技术药物的应用举例
1、重组人红细胞生成素
人红细胞生成素是祖细胞增殖的重要调节因子，当红细胞生成素缺乏时则出现贫血。
正常生理条件下，在人体染色体的基因控制下，红细胞生成素由肾小管的间质细胞分泌、而后被运至骨髓，与红细胞膜表面上的高亲力受体结合，促进红细胞分化，与低亲力受体结合，促进红细胞增殖，使骨髓刺激因子增加，并能阻碍红细胞的程序性死亡及提高红细胞的抗氧化作用。
临床应用的重组人红细胞生成素是利用DNA重组技术合成的，分子量约为20kDa，含165个氨基酸，其生物活性与内源性红细胞生成素具有相似的效应及动力学，它促进红祖细胞增殖、分化、成熟，网织红细胞数目、红细胞压积、血红蛋白含量均增加。
目前临床主要用于各种原因所致的红细胞生成素缺乏性贫血，用于慢性肾功能不全，改善腹膜透析患者的贫血，也用于肿瘤化疗及某些免疫性疾病、风湿性关节炎、艾滋病、严重寄生虫病所致的贫血，还能促进骨髓移植患者造血功能的恢复。
主要不良反应常见的有血压升高、故高血压患者不宜应用。
注射部位及血液透析后易致血栓形成，血粘度升高；注射后可出现流感性症状，如头痛、骨痛、寒战、癫痫发作、皮肤瘙痒、眼部水肿等，有过敏史者不宜应用。
2、白介素-2（白细胞介素-2）
本品为含133个氨基酸的糖蛋白，药用品为基因重组人白介素-2，分子量为15420，重组的白介素-2没有经过糖基化，氨基末端没有丙氨酸，125位上由丝氨酸取代半胱氨酸。
作用强度用国际单位表示，1.1mg重组白介素-2等于1.8千万国际单位。
白介素-2通过与白介素-2受体特异结合而产生作用，包括：
增强淋巴细胞增殖和白介素-2依赖性细胞株生长；增强淋巴细胞介导的细胞毒性和杀伤细胞活性；诱导INF-γ活性。
临床用于治疗转移性肾癌和黑色素瘤等，也可用于病毒和细菌的感染。
临床用药多为连续输注或多次间断给药，腹腔内或皮下注射可使血中白介素-2水平维持较久，达2～6小时。
白介素-2的毒性反应多与血管通透性即血管渗漏综合征有关，并随剂量增大而加剧，导致体液渗出而器官功能障碍，其中肾功能损害最为严重，主要表现为寒战、发热、皮肤瘙痒。
毒性反应还可表现有消化道症状、谷丙转氨酶和血肌酐升高、水肿、少尿、低血压、贫血、血小板减少症以及通气和肺功能异常，严重者出现支气管痉挛、肺水肿、呼吸困难和心律失常。
对中性粒细胞的损害可能导致感染扩散。
对本品过敏史者禁用，过敏体质、心脏病患者、严重肝肾损害者慎用。
3、干扰素
干扰素是一类小分子糖蛋白，病毒感染或诱生剂可以促使一些细胞产生。
根据细胞来源和抗原特异性不同，可分为三型：
由人白细胞产生的α-干扰素，人成纤维细胞产生的β-干扰素和人T细胞产生的γ-干扰素。
现在利用基因工程技术可以从大肠杆菌来源获得大量的重组的干扰素。
α-干扰素有二十多种亚型，β-干扰素有二种亚型，γ-干扰素有一种亚型。
干扰素口服无效，须注射给药，最初的主要作用是抗病毒，后来发现其有很重要的免疫调节作用。
干扰素α具有广谱抗病毒作用，干扰素结合到特异性细胞表面受体上，启动一系列细胞内过程：
诱导某些酶活性（如诱导机体组织细胞产生抗病毒蛋白酶而抑制病毒的复制）；抑制细胞增殖；增强免疫活性，包括提高巨噬细胞的吞噬活性和T细胞的特异性细胞毒性。
干扰素α2b：
分子量15000～27000之间，临床用于治疗（常和利巴韦林联合）病毒感染性疾病如慢性病毒性肝炎（乙、丙、丁型），还可以用于治疗多种肿瘤如白血病、黑色素瘤、艾滋病有关的卡波济肉瘤和尖锐湿疣。
不良反应可有常见的流感样症状包括头痛、发热、寒战。
还可见低血压、心律失常；偶见心肌病、心肌梗死、中枢抑郁和模糊等。
干扰素β1a：
为165个氨基酸残基的糖蛋白。
具有抗病毒和免疫调节作用，主要用于治疗多发性硬化，机制不清楚，可以发生流感样症状和注射部位反应。
干扰素γ1b：
一种多肽，与其他干扰素不同的是，此种干扰素主要激活巨噬细胞的吞噬活性，促进这些细胞产生活性氧代谢物，对许多微生物有毒性作用。
主要用于与慢性肉芽肿性疾病有关的严重感染。
不良反应可有发热、头痛、皮疹、疲劳、胃肠道不适、食欲不振、体重丢失、肌痛、抑郁。
4、乙肝疫苗
第一代乙肝疫苗，属血源疫苗，由无症状乙型肝炎表面抗原阳性者的血浆制备而得。
因提取工艺不同，疫苗所含成分也有一定的差别，但均含有22nm小颗粒乙型肝炎表面抗原。
血源疫苗曾对防止乙肝流行发挥了重要作用，但是，疫苗的成本高、生产周期长（65周），还存在传播艾滋病和肝炎的潜在危险。
第二代乙肝疫苗，将编码乙型肝炎表面抗原的基因在哺乳动物细胞或酵母菌中高效表达，得到乙肝基因工程疫苗，接种者中约有10%不产生应答反应；另有5%～15%接种者属低应答者，低应答者不能获得完全保护作用。
第三代乙肝疫苗，乙肝病毒包膜的抗原性主要由S抗原和前S1、前S2抗原组成组成，美国Medeva制药公司利用基因重组技术，在哺乳动物细胞成功地表达了包含S抗原和前S1、前S2抗原的第三代重组疫苗，1998年用于临床，能诱导更高的血清阳转率和抗体应答反应。
新生婴儿，特别是母亲为乙型肝炎表面抗原阳性的新生婴儿，产后应立即给婴儿接种乙肝疫苗，学龄前和学龄儿童亦应接种。
一般人群（包括新生婴儿）正常接种：
上臂三角肌肌肉注射，全程注射三次，每次注射10μg，第一次注射后隔三个月和六个月注射第二次和第三次。
第三节 生物技术药物的研究发展趋势
一、生物技术药物的发展已进入蛋白质工程药物的新时期
第一代重组生物技术药物逐步被第二代所取代，蛋白质工程技术日新月异，点突变技术、融合蛋白技术、定向进化、基因插入及基因打靶等技术使蛋白质工程药物新品种迅速增加。
通过蛋白质工程手段可以提高重组蛋白的活性，改善制品的稳定性，提高生物利用度，延长在体内的半衰期，降低制品的免疫原性等。
如天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓了胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了降血糖作用，也增加了抗原性。
这是胰岛素某些氨基酸残基结构所致，改变这些残基，则可降低聚合作用，使胰岛素快速起作用。
蛋白质工程技术在单抗人源化和制造融合蛋白方面也发挥了重大作用。
当然蛋白质工程产品也有潜在缺点，如可能因结构与天然蛋白不同而增加免疫原性或降低了生物活性与治疗价值或改变了药效学和药动学性质，因此临床研究时，应特别仔细观察。
二、新的高效表达系统的研究与应用
从基因工程药物表达的研究策略看，迄今为止，已上市的生物技术药物（DNA重组产品）多数是在E.coli表达系统生产的；其次是幼仓鼠细胞和酿酒酵母菌等，正在进一步改进的重组表达系统有真菌、昆虫细胞和转基因植物和动物。
转基因动物作为新的表达体系之所以更令人关注是因为能更便宜地生产复杂产品，目前主要有α1-抗胰蛋白酶，α-葡萄糖苷酶和抗凝血酶Ⅲ等产品已进入临床试验，还有20种产品正在用转基因山羊、绵羊或牛进行早期开发。
实现用转基因动物进行生物技术药物生产，用于医疗已指日可待，通过克隆动物用于生物技术药物生产也具有广阔的发展前景，如用克隆羊使其带有人Ⅸ因子基因，用于制备Ⅸ因子。
三、将基因组研究成果转化为生物技术新药的研究与开发
蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的表达方式和功能方式的学科。
蛋白质组学研究的兴起，标志着生命科学研究水平进入高通量和整体性研究阶段，因为蛋白质具有自身的特殊活动规律，如后修饰加工，转运定位，结构形成，蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与核酸的相互作用等。
这些均不可能从细胞水平或基因水平上研究获知。
通过蛋白质组学研究，可以探索蛋白质在质量、功能、相互作用及关联网络系统的整体性、时控性和调控性，从而揭示机体的生理与病理过程，因此蛋白质组学的研究将为新药的研发提供强大的物质基础。
人类基因组计划的研究成果与生物信息学的结合将极大地加快生物技术新药的研发速度，现有药物作用靶标约500个，通过药物基因组学和药物蛋白质组学的研究，药物作用的靶标将增至3000～100000个，必将进一步阐明在一个特定细胞内表达的功能蛋白或在特异疾病状态下或代谢状态下表达的蛋白组，从而为药物研究提供更多的信息。
这些新靶点一旦被鉴定，通过分子模拟的合理的药物设计或蛋白工程技术，可以设计出更多的新药或获得更有治疗特性的新治疗蛋白。
目前从人类基因组计划的研究初步结果中，已获得3000多个基因可用来研究、开发生物技术药物，这将推进生物技术药物的更快发展。
蛋白质组学的研究内容包括：
①发现疾病特异相关蛋白，如肿瘤相关标志蛋白，可用作肿瘤诊断和治疗药物的作用靶标。
②研究不同个体、不同生理病理状态下药物代谢酶谱的变化，为药动学和临床提供专一依据，从而发展个性化用药途径。
③研究药物不良反应、毒副作用方面的蛋白质组学，为合理用药提供依据，从而建立个体的蛋白质组数据库，用于患者的蛋白质谱分类和执行个性化用药。
④应用蛋白质组学技术，从传统中药中寻找天然活性物质，为实现中药现代化提供生物技术手段，如对昆虫毒素的系统活性分析，可以找到提供DNA重组生产的目的蛋白及其功能基因。
四、研究与开发生物技术药物的新剂型
生物技术药物多数易受胃酸及消化酶的降解破坏，其生物半衰期也普遍较短，需频繁注射给药，造成患者心理与身体的痛苦。
即使皮下或肌肉注射，其生物利用度也较低。
另外多数多肽与蛋白质类药物不易被亲脂性膜所摄取，很难通过生物屏障。
因此生物技术药物的新剂型发展十分迅速，如对药物进行化学修饰，制成前体药物，应用吸收促进剂，添加酶抑制剂，增加药物透皮吸收及设计各种给药系统等。
主要方向是研究开发方便合理的给药途径和新剂型：
①埋植剂缓释注射剂，尤其是纳米粒给药系统具有独特的药物保护作用和控释特性。
②非注射剂型，如呼吸道吸入、直肠给药、鼻腔、口服和透皮给药等。
1、埋植剂：
微型渗透泵埋植剂，其外形像胶囊，植入后，体液可透进外壳，溶解夹层电解质层，使夹层的体积膨胀，压迫塑性内腔，使药物从开口处定速释出，已有肝素和胰岛素等埋植剂在动物体内外的实验研究报道。
可注射的埋植剂，以生物降解聚合物作为埋植剂或注射型缓释剂的骨架，常用的有两类：
①天然聚合物，如明胶、葡聚糖、白蛋白、甲壳素等。
②合成聚合物如聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸-羟乙酸（PLGA）、聚丙交酯乙交酯（PLCG）、聚己内酯、聚羟丁酸等。
其中PLGA在体内降解为乳酸、羟乙酸进一步分解为CO2和H20，具有良好的生物相容性，无免疫原性，安全性高，并可通过聚合单体比例和聚合条件调节聚合物在体内的降解速度，其应用越来越广泛。
2、微球注射剂：
有多种注射型微球的制备方法，如相分离法、复乳-液中干燥法、喷雾于燥法、低温喷雾提取法、熔融挤出法等。
多肽微球注射剂：
采用生物可降解物，特别是PLGA为骨架材料，包埋多肽、蛋白质类药物制成注射型微球，使在体内达到缓释的目的。
最成功的品种是LHRH类似物微球，其缓释作用达到1～3个月，用于治疗前列腺癌、子宫肌癌、子宫内膜异位及青春期性早熟等。
3、纳米粒给药系统：
纳米粒是粒径小于1μm的聚合物胶体给药体系，按制备过程不同可分为纳米球和纳米囊。
目前已有采用W/O乳化-蒸发方法制备的载有亲水性多肽药物促黄体激素释放激素类似物的纳米球、双乳化-溶剂蒸发法制备载有L-门冬酰胺酶的纳米球，粒径为200nm，药物包封率达40％；还有用沉淀法制备纳米球，如制备环孢素A纳米球，操作简便，粒径小，包封率高，以聚氰基丙烯酸异丁酯为载体，采用界面缩聚技术制备胰岛素纳米粒，不仅包封率高，而且能很好地保护药物，其降糖作用可持续24小时，此法还用于制备降钙素纳米粒。
许多结果表明纳米粒给药系统可有效的延长多肽和蛋白质药物的释放，同时可提高生物技术药物的生物利用度，因此在输送生物技术药物方面具有广阔应用前景。
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