正交设计优选荞麦粉中黄酮成分的提取工艺.docx
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正交设计优选荞麦粉中黄酮成分的提取工艺
分类号:
R283
单位代号:
10452
毕业论文（设计）
正交设计优选荞麦粉中黄酮成分的
提取工艺
姓名何保富
性别男
学号200308240109
年级2003级
专业应用化学
系（院）化学化工学院
指导教师张杰
2007年4月7日
正交设计优选荞麦粉中黄酮成分的
提取工艺
ResearchonOptimumExtractionProcessofFlavonoidsfromBuckwheatthroughOrthogonalDesign
学位论文完成日期：
2007年4月7日
指导教师签字：
目录
摘要3
Abstract3
1前言4
1.1荞麦简介4
1.2荞麦的化学成分4
1.3荞麦有效成分简介4
1.4荞麦黄酮提取工艺5
1.5总黄酮的测定方法5
1.6荞麦生物类黄酮应用与开发前景7
2试验部分7
2.1仪器、试剂与材料7
2.2试验方法8
2.3正交试验设计9
2.4数据处理与结果分析9
3．结论12
参考文献13
致谢14
正交设计优选荞麦粉中黄酮成分的提取工艺
摘要
对荞麦粉中黄酮类化合物的最佳提取工艺进行了优化。
通过L9（33）正交试
验,研究了乙醇浓度（A）、提取时间（B）和固液比（C）对黄酮类化合物提取率的影响，用紫外分光光度计测定了荞麦提取液中黄酮的含量。
结果显示，乙醇浓度对提取率的影响较为显著,优化的工艺条件为：
乙醇浓度80%、提取时间6h、料液比1：
40。
关键词:
正交设计；荞麦粉；总黄酮；芦丁；紫外可见分光光度计
ResearchonOptimumExtractionProcessofFlavonoidsfromBuckwheatthroughOrthogonalDesign
Abstract
Theoptimaltechnologicalconditionsforextractionofflavonoidsinbuchwheatflourwereresearched.OrthogonaldesignmethodsL9（33）wereappliedtoanalyzetheinfluenceoffactorssuchasconcentrationofethanol,extractiontimeandtheratioofseedstocktosolventontheextractionpercentofflavonoids.Thecontentofflavonoidswasdeterminedbyspectrophotometry.Theresultsindicatedthatconcentrationofethanolsignificantlyaffecttheextractionpercentofflavonoids.Theoptimumconcentrationofethanolis80%,extractiontimeis6handtheratioofseedstocktosolventis1:
40.
Keywords:
Orthogonaldesign;Buckwheatflour;Flavonoids;Rutin;
UV-Visspectrophotometer
1前言
1.1荞麦简介
荞麦属双子叶蓼科（polygonaceae）荞麦属（FagopyrumescucentumMoench）植物，又名三角麦，也称作野荞麦，是一种药食两用植物，植物学上主要有苦荞麦（Fagopyrum，tataricum，（L）Gaertn）和甜荞麦（Fagopyrum．esculentum，Moench）两种栽培品种。
据研究，荞麦的原产地在中国东北的黑龙江流域及西伯利亚的贝加尔湖一带。
世界上产荞麦最多的国家是前苏联、波兰、法国、加拿大、奥地利等。
虽然盛产荞麦的国家集中在欧洲，但是荞麦传入欧洲比较晚，大约始于13～14世纪。
据有关文献记载，1396年德国首先引种荞麦，17世纪初，传入法国、意大利和英国，1625年荷兰人把荞麦种传入美国，之后又传入加拿大和南美洲[1]。
荞麦在我国境内自然野生的历史已有两千余年之久。
它是一种适于在冷凉气候下生长的短季作物，荞麦麦耐旱、耐寒、耐酸、耐瘩，生长期短（90-100d左右），在我国四川凉山、云贵、晋、冀高原等处均有分布，年产约一亿公斤[2]。
1.2荞麦的化学成分
荞麦营养丰富，蛋白含量达ll%-15%，包括人体必需的8种氨基酸，含有9种脂肪酸类物质，其中80%是不饱和脂肪酸，是非常有利于中老年人的食品，且荞麦的茎、叶、根、花、籽粒、壳中均含有黄酮类化合物和硒、镁等有益于人体的元素。
现代医学研究表明苦荞不仅含有较为全面的氨基酸，丰富的油酸、亚油酸，多种维生素及微量元素等，是一种营养价值极为丰富的绿色食品，而且富含其它谷类粮食所不具有的叶绿素和类黄酮，赋予苦荞降血压、降血脂和降血糖等生理功能[3]。
荞麦中含有大量生物类黄酮，国内外学者对荞麦的壳、全籽粒、糊粉层、叶、茎、花中生物类黄酮资源的化学组成、抗氧化性和稳定性进行大量分析研究。
荞麦具有防治糖尿病、高血压、冠心病、抗癌、防止内出血，延缓衰老等多种生理功能。
研究表明荞麦这些生理功能和药用价值与荞麦中富含生物类黄酮有十分密切关系[1]。
1.3荞麦有效成分简介
黄酮类化合物是一类广泛存在于植物体内的天然色素，这类化合物具有抗菌、抗病毒、抗过敏、抑制癌细胞等多种药理活性，对治疗癌症、心血管等疾病有重要意义[4]。
黄酮类化合物又名芦丁（维生素P），不仅在医学上有着广泛的应用，在食品工业中可以作天然着色剂、抗氧化剂和功能性食品的原料。
目前，国内提取芦丁的原料主要是槐花，其资源稀少，不能充分满足市场需要，因此，寻找其它资源便成为人们十分关注的问题[5]。
芦丁（Rutin,也称芸香苷）是维生素P的主要成分之一，属于黄酮类衍生物。
医学研究表明：
芦丁具有降低毛细血管通透性、维持血管正常的渗透压；有助于保持、恢复毛细血管的正常弹性的功能；对多种炎症也具有良好疗效；芦丁能治疗闭塞性脑血管症的药物，临床用于脑血栓所致的偏瘫、失语以及动脉硬化等症。
目前,随着我国人口结构向老龄化的转变，对预防和治疗心脑血管疾病的药物如芦丁片、羟基芦丁等的需求量逐年增加，因此开发利用极为丰富的植物资源，从中提取具有药用价值的芦丁，对于发展农村经济具有很好的经济效益。
芦丁广泛存在于一些植物中，在槐花米、荞麦叶、蒲公英、桑树叶、银杏中及烟叶中含量较多。
从槐花米中分离提纯芦丁的研究已有报导。
苦荞麦作为北方一种常见农作物，分布广泛。
如果将苦荞麦中的芦丁提取出来，不但可以改变芦丁的来源短缺情况，对于改善边远山区贫穷落后面貌，同样具有重要的现实意义。
1.4荞麦黄酮提取工艺
目前，荞麦黄酮的提取方法有热水浸提法、乙醇浸提法、有机溶剂索氏提取法、碱性水或碱性稀醇提取法、碱提酸沉法及酶法等。
从操作的简易程度和提取成本来看，热水浸提法无疑具有一定优势，但该法的缺点是提取的黄酮产量低而杂质多，这是由于苦养籽壳中的黄酮类化合物以甙元形式存在的较多，游离甙元属于平面型分子，堆砌紧密，分子间引力较大，水分子难于进入，因此难溶于水[5]。
用乙醇来提取生物类黄酮具有较好的提取效果，所得黄酮产量高，具有较好的外观性状，这是因为生物类黄酮因其结构和来源不同，溶解特性差异很大，因此提取溶剂极性的差异对产物的种类会有很大的影响。
据陈运中[6]报道，从苦荞麦粉中提取黄酮类化合物最佳工艺条件为：
以60％乙醇水溶液为提取剂，固液比1：
10，在50℃条件下振荡提取1小时。
贾冬英[7]对苦荞麦茎及籽壳中总黄酮的提取工艺研究结果为：
以20-30倍原料重65％乙醇水溶液为提取剂，在70℃-75℃浸提4～6小时为最佳工艺条件。
王岚[8]认为将粉碎原料置于连续式或间歇式萃取罐中，进行逆流萃取，这样逐步提高萃取液浓度，形成一定的浓度梯度，提高萃取效率，增加设备利用率，同时由于物料的自过滤作用降低萃取液中固形物含量，采用乙醇作溶剂是一种切实可行的方法。
徐宝才[9]得出苦荞壳中黄酮提取最佳工艺条件是用30倍原料重80％乙醇溶液，在70℃条件下提取2小时，得壳中黄酮含量为0.695％。
吴梅林等研究了用纤维素酶酶解法提取苦荞总黄酮工艺。
与传统的乙醇提取工艺相比,总黄酮得率提高了18.92%。
实验确定了最佳提取条件:
酶浓度0.40mg/mL,酶作用时间120min,酶解温度50℃,酶解介质pH值为4.5,乙醇浓度70%,提取温度70℃。
1.5总黄酮的测定方法
目前，荞麦黄酮的测定方法有分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、平板色谱法、高效毛细管电泳法和液质联用法等。
1.5.1分光光度法
欧阳平[10]等用分光光度法测定了苦荞麦中总黄酮的含量。
苦荞粉先用乙醚抽提除杂，再用乙醇索氏抽提，以芦丁为标准品，以硝酸铝-亚硝酸钠为显色剂，在500nm处测定吸光度，测得了总黄酮含量。
经考察，此法简单易行，结果稳定。
1.5.2气相色谱法
此法具有高选择性，高效能，高灵敏度，分析速度快等特点，但是黄酮类化合物沸点高，对热不稳定，需将样品用衍生话试剂制成黄酮衍生物，才能用于气象色谱分离鉴定。
1.5.3高效液相色谱法
HPLC具有分离效果好，准确性好，分离速度快及仪器自动化程度高等特点，尤其适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大及离子型化合物得分析，已广泛用于天然产物得分析。
黄酮类化合物HPLC分析通常用反相C18色谱柱，由于黄酮分子中存在酚羟基，流动相中加入少量的酸即可。
包括等度洗脱法和梯度洗脱法。
但HPLC价格昂贵，且测定前处理时间较长，不适用于快速分析及一般中小企业采用[10]。
周强等研究了用了用微柱高效液相色谱测定苦荞中芦丁的方法。
苦荞中芦丁用80%甲醇加热回流提取，以WaterXterraRP18（1.0x50mm,2.5um）为固定相，1%醋酸和甲醇为流动相，在该色谱条件下，苦荞中的芦丁在1分钟内可达到基线分离，用紫外二极管矩阵检测器检测，得到较满意的结果。
1.5.4平板色谱法
平板色谱主要指纸色谱（PC）和薄层色谱（TLC）。
PC由于选择性和重现性差，目前应用不普遍，而且一般不用于定性分析。
TLC操作简单快捷，不需要贵重的仪器设备，杂质对色谱系统的干扰破坏性小，分析成本低。
但分析的时间较长，结果重现性差。
1.5.5高效毛细管电泳法
它具有高效、快速、进样体积小、溶剂消耗小和抗污染能力等特点。
其分离模式为毛细管区带电泳（CZE）、胶束动电毛细管电泳（MECC）、毛细管等速电泳（CITP）、毛细管凝胶电泳（CGE）、毛细管等电电泳（CIEF）、毛细管电色谱（CEC）。
最近几年用于黄酮类化合物分析较多的是CZE和MECC，也有应用CITP。
1.5.6液质联用法
徐宝才[11]等采用RP-HPLC-DAD/MS在苦荞籽粒中发现了山奈酚;并对苦荞中的总黄酮和其中的四种主要黄酮醇：
槲皮素-3-芸香糖葡萄糖苷（I）、芦丁（II）、山奈酚-3-芸香糖苷（III）,槲皮素（（IV）进行了定量。
总黄酮含量为0.174%-4.614%。
（I）,（II）,（III）,（IV）在壳、麸皮、外层粉、心粉、山西苦荞粉中的含量分别为0.0153-0.0448%、0.0816-4.1054%、0.0043-0.1330%、0.0062-0.5332%。
1.6荞麦生物类黄酮应用与开发前景[1][12]
现代医学研究证明，黄酮类化合物具有抗氧化、平、寒、无毒，实肠胃，益气力，续精神，能炼五脏滓秽。
作饭食，压丹石毒，甚良。
以醋调粉，涂小儿丹毒处赤肿热疮。
降气宽肠，磨积滞及抗自由基、抗癌、防癌，调节心血管系统、内分泌系统、免疫系统，护肝、抑菌、抗病毒等多种生理功能。
芦丁对维持血管张力，降低其渗透性，减少脆性有一定作用，还可维持微血管循环，并加强维生素c在体内蓄积。
还有降低人体血脂、胆固醇，防止心脑血管疾病作用，用作动脉硬化、高血压的辅助治疗剂、对脂肪浸润肝有祛脂作用，与谷胱甘肽合用去脂效果更明显。
目前芦丁已成为医药、食品中一种非常重要的原料，在临床上，芦丁用作毛细血管脆性引起出血症及高血压辅助治疗药，如复方芦丁片、曲克芦丁片、羟乙基芦丁片。
此外，利用芦丁生产的药品还有化痔胶囊、复胆片、力可生颗粒剂、胃血停冲剂等。
利用芦丁对紫外线的强烈吸收作用，芦丁还被用于生产防晒剂（如芦丁—黄芩苷防晒剂、芩芦凝胶防晒剂）。
国外也常用芦丁作食品及饮料染色剂。
经芦丁降解的苷元槲皮素可治疗支气管炎、咳嗽、抗炎症等。
国内外对芦丁的需求量很大。
除芦丁外，荞麦中还含有荭草苷、牡荆苷、槲皮素、异牡荆苷、异荭草苷、儿茶素、原儿茶素、海棠苷、栎皮酮、3,4-黄烷二醇等黄酮类化合物，它们的生物活性强弱、特点各不相同，使得荞麦黄酮具有更多开发潜力。
2试验部分
2.1仪器、试剂与材料
2.1.1仪器
760CRT双光束紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；
FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司天平制造）；
GSY—Ⅱ型电热恒温水浴锅（北京市医疗设备厂）
2.1.2标准品
芦丁，中国药品生物制品检定所提供，标号为100080-200506
2.1.3试剂
无水乙醇（分析纯，莱阳市康德化工有限公司）
亚硝酸钠（分析纯，莱阳市康德化工有限公司）；
硝酸铝（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司）；
氧化钠（分析纯，济南市化工研究所）。
各配制成5%的NaNO2、10%的Al（NO3）3、4%的NaOH溶液，备用。
2.1.4材料
荞麦粉，市场购买。
过40目筛备用。
2.2试验方法
2.2.1芦丁测定实验原理
当前在实验室环境中，主要用硼酸-柠檬酸法、硝酸铝-亚硝酸钠-氢氧化钠法、氯化铝-乙酸钠法及芦丁法来测定苦荞粉中黄酮类化合物的含量，从参考文献[13]中查阅知，芦丁法仅可测定苦荞提取液中部分黄酮类化合物的含量，而氯化铝法和硼酸-柠檬酸法无法将黄酮类化合物全部络合，故本试验选择硝酸铝法作为荞麦粉中黄酮类化合物的含量测定方法。
硝酸铝比色法的测定原理：
黄酮类物质是以2-苯基并吡喃酮为母核的多羟基化合物，可与糖苷类物质遇碱变成明显的黄色，其机制是黄酮类物质在碱性条件下其苯吡喃酮的1，2碳之间的C-O键打开成查尔酮，其检测方法常用分光光度计法或者液相色谱法（本实验采用分光光度法）。
分光光度法是用黄酮与铝离子在碱性与亚硝酸存在条件下形成黄酮的铝络生物，形成稳定的黄色。
黄色的深浅与黄铜的含量呈一定的比例关系，可以芦丁（标准样）做标准，于一定波长处比色定量测定[14]。
2.2.2标准曲线的绘制
2.2.2.1标准溶液的制备
准确称取真空干燥至恒重的芦丁标准品0.0500g，用30%乙醇水浴微热溶解，并完全转入100mL，用30%乙醇定容，得0.5000mg/mL的芦丁标准溶液。
2.2.2.2测定波长的选择
量取芦丁标准液1.00mL，置10mL刻度试管中，加30%乙醇至5mL，加5%NaNO20.30mL，摇匀后放置5min，加10%Al（NO3）30.30mL，摇匀后放置6min，加4%NaOH2.00mL，再用30%乙醇稀释至刻度，摇匀后放置10min，置1cm比色皿中，在波长400-600nm之间扫描，作吸收波谱。
测定结果表明，最大吸收波长为505nm。
2.2.2.3标准曲线的建立
精密吸取0.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00mL上述芦丁标准溶液，分别置于6支10mL刻度试管中，按2.2.2.2项下的方法，自“加30%乙醇至5mL”起，同法操作，于505nm测定吸光度（30%乙醇做测定空白），其结果见表1。
表1芦丁标准液浓度—吸光度值
芦丁浓度C（g/L）
0.0000
0.1000
0.1500
0.2000
0.2500
0.3000
吸光度A
0.049
0.193
0.271
0.346
0.423
0.500
用最小二乘法做线形回归，得回归方程：
C=0.664×A-0.030，相关系数γ=0.9998。
芦丁标准液浓度C与吸光度A的关系曲线，如图1。
图1芦丁标准液浓度C与吸光度A关系曲线
2.3正交试验设计
2.3.1因素与水平
根据正交试验的设计方法，选取乙醇浓度（A）、提取时间（B）和料液比（C）为考察因素，采用3因素3水平正交表，即L9（33）正交表作正交试验。
因素的水平设定如表2所示。
表2从荞麦中提取黄酮的实验因素及其水平设置
水平
Levels
A（乙醇浓度）
Concentration/%
B（提取时间）/h
Time
料液比
g/ml
1
60%
2
1：
20
2
70%
4
1：
30
3
80%
6
1：
40
2.3.2荞麦粉中黄酮的提取及含量测定
（1）各种提取工艺条件下黄酮提取液的制备：
准确称取荞麦粉样品2.000g，用脱脂滤纸包好后，置索氏提取器中，按正交实验表所列工艺条件，做对比实验。
提取结束后，将圆底烧瓶内提取液转入100mL容量瓶，用乙醇定容。
所得试液编号分别为1-9。
（2）荞麦粉中总黄酮的提取：
准确称取荞麦粉样品2.000g，用脱脂滤纸包好后，置索氏提取器中，加无水乙醇80mL，在95℃条件下水浴加热回流，提取至无色。
冷却后，将圆底烧瓶内提取液转入100mL容量瓶，用乙醇定容。
所得试液编号为10。
（3）所得试液中黄酮含量的测定：
精密吸取各试液（提取液1-10号）1.00mL于10mL刻度试管中，自“加30%乙醇至5mL”起，按2.2.2.2项操作，依法测定吸光度，代入回归方程，计算样品中总黄酮的含量。
2.4数据处理与结果分析
2.4.1各供试液黄酮含量测定结果
由所得1-10号供试液的吸光度代入回归方程，计算样品中总黄酮的含量及黄酮提取率，结果见表5。
表5样品总黄酮含量测定结果及黄酮提取率
样品号
吸光度A
总黄酮浓度c（mg/mL）
含量Ω（%）
提取率ω（%）
1
0.081
0.024
1.2
37.16
2
0.137
0.061
3.05
62.8
3
0.138
0.062
3.1
63.3
4
0.095
0.033
1.65
43.6
5
0.136
0.060
3.0
62.4
6
0.162
0.078
3.9
74.3
7
0.215
0.113
5.65
98.6
8
0.150
0.070
3.5
68.8
9
0.180
0.0875
4.4
82.6
10
0.218
0.115
5.75
100
附：
含量的计算公式：
Ω=c/2×100%
提取率的计算公式：
ω=A/0.218×100%
2.4.2正交试验结果及分析
以荞麦粉中黄酮的提取率为评价指标，按表4进行的正交试验的结果及提取率随各因素的变化曲线图分别见表6和图2。
表6从荞麦粉中提取黄酮的正交实验结果
实验号
NO
A
B
C
黄酮提取率（%）
1
1
1
1
37.2
2
1
2
2
62.8
3
1
3
3
63.3
4
2
1
2
43.6
5
2
2
3
62.4
6
2
3
1
74.3
7
3
1
3
98.6
8
3
2
1
68.8
9
3
3
2
82.6
K1
163.26
179.36
180.26
K2
180.3
194
189
K3
250
220.2
224.3
k1
54.42
59.79
60.09
k2
60.1
64.67
63
k3
83.33
73.4
74.77
R
28.91
13.61
14.68
图2提取率随乙醇浓度、提取时间、料液比对的变化曲线
由正交试验结果及极差分析可知：
（1）所考察的三个因素中，因素A（乙醇浓度）的极差最大，其次是因素C（料液比），而因素B（提取时间）的极差最小。
又结合图2所示，提取率随因素A的波动最大。
而实验指标的变动越大，则该因素对实验指标的影响越大。
从而可决定三因素对黄酮提取率产生影响的主次顺序为：
主→→→次
ACB
（2）由图2，对乙醇浓度，提取率最高的水平A3；对料液比，取提取率最高水平B3；对提取时间，取提取率最高水平C3。
从而由正交试验，得到较优的工艺条件A3B3C3。
一般来说，它要比九次中的最好条件A3B1C3（即7号实验）还要好。
2.4.3讨论
（1）在设计本实验中，查阅大量文献后，也曾经把提取温度作为主要影响因素进行考察。
以无水乙醇作为提取剂进行实验，考察温度对提取效果的影响，观察到如表7所列的现象。
表7以提取温度为考察对象时的实验现象
温度条件
现象
60-70℃
提取器内无明显现象
70-80℃
烧瓶口出产生少量水蒸气凝结，但仅在索氏提取器端口处，提取液长时间不变色
80-90℃
烧瓶内乙醇沸腾，部分蒸气可通过侧管到达上部，并在上升过程产生凝结。
回流效果不明显，提取液颜色很浅，几乎是无色。
90-100℃
回流现象较为明显，提取液黄色。
由于以上实验结果和参考文献有出入，因此本实验并没有把提取温度作为主要影响因素列入正交试验设计中进行考察。
这一现象值得进一步考察。
（2）荞麦提取过程中的影响因素有溶剂种类、溶剂浓度、提取温度、料液比、提取时间等[13]。
本试验经分析比较，选取乙醇浓度（A）、提取时间（B）和料液比（C）为主要影响因素，结果表明乙醇浓度对提取效果的影响最大，其余两因素的影响稍逊色一些。
分析其原因认为，芦丁在不同浓度乙醇中的溶解性依次为:
80%>70%>60%，即随醇浓度的增大，芦丁的溶解性也随之增大，因此提取液中芦丁的含量便显著提高。
料液比可由溶解度来限制提取的结果，而对索氏提取器的选择，从一定程度上也会对料液比产生影响。
3．结论
（1）通过乙醇提取荞麦粉中黄酮类成分的正交试验表明，影响提取效果的主要因素是乙醇浓度，其次是料液比，而提取时间的影响较小。
乙醇索氏提取荞麦粉中黄酮的最佳工艺条件为A3B3C3，即：
乙醇浓度为80%，料液比为1：
40，提取时间为6h。
（2）本实验利用吸光光度法对荞麦粉中提取的总黄酮含量进行测定,利用黄酮类化合物中含有的酚羟基和环酮基结构,可与某些金属盐试剂反应,生成有色络合物,如与铝在碱性溶液中生成红色络合物,在一定范围内其浓度和吸光度符合比耳定律,进行吸光度定量。
本法操作简单易行,结果稳定可靠,可用于含黄酮类化合物的保健食品及提取物的测定。
（3）本实验应用乙醇溶液做为提取介质进行提取荞麦粉中总黄酮的研究，实现了绿色环保工艺。
（4）提取温度对荞麦粉中黄酮成分的提取工艺的影响有待进一步考察。
参考文献
[1]尹礼国，曾凡坤，钟耕等.荞麦生物类黄酮研究现状[J].粮食与油脂，2002，12：
22-24
[2]郭京波，王向东，张燕等.不同提取方法对苦
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