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椎间盘退变动物模型研究进展
椎间盘退变动物模型研究进展
【关键词】椎间盘退变
常用于研究椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration,IVDD)的发生机制和检测介入治疗手段有效性的动物实验模型可分为体内、体外和计算机模拟实验三种。
体外实验模型和计算机模拟实验模型研究IVDD有明显的局限性,所以常用的实验方法仍然是体内研究。
体内椎间盘退变模型可分为自发性和诱导性两种。
自发性椎间盘退变模型是通过系统方法引起动物遗传改变,或通过改变喂养食物引起动物行为方式改变而引起IVDD发生。
诱导性椎间盘退变模型又可分为机械性损害模型和结构性损害模型。
为了更好地了解各种动物模型的优缺点,本文对椎间盘退变动物模型进行了比较,分析其与人类可能的相关性。
1动物模型的要求及动物选择
关于IVDD动物模型的方法已经有多种报道,所选择的动物和方法的可靠性、可重复性亦存在较大差异[1]。
建立的动物模型要求与人类的IVDD具有相似性和可比拟性。
应包括以下几个方面:
a)能再现椎间盘退行性病变的客观规律;b)模型重复性好;c)所选的动物解剖和生理特点尽可能与人类近似。
动物模型制备已经有近75年的历史。
Lob等(1933)损伤兔的纤维环后观察到椎间盘产生与人类椎间关节病相似变化。
Key等(1948)首先报道实验动物椎间盘退行性改变。
灵长类在生物进化方面同人类的亲缘关系比较密切,解剖生理特点与人类最为近似,如恒河猴是用于制作人椎间盘退变模型最为理想的动物,但是由于经济因素,其应用受到一定限制。
近十几年来,倾向于选用猪、狗、羊等传统动物制作模型。
目前大鼠是最常用的实验动物,具有价格低廉,饲养方便,可适用大规模实验等优点,而且其椎间盘在解剖和生化结构上与人类椎间盘非常相似[2]。
2椎间盘退变动物模型的建立
诱发性椎间盘退变模型
机械模型
应力改变致椎间盘退变模型流行病学研究显示IVDD与应力有关。
生物力学因素在IVDD中的作用非常突出,首先异常的应力可直接损伤椎间盘结构。
Kuga等[3]用两岁大鼠(相当于20~40岁的人)椎单位进行疲劳应力试验发现纤维环易于发生破裂,有时可伴软骨终板破裂,显示椎间盘突出是纤维环破裂引起,而与髓核无关。
然而,更重要的是力学因素可通过影响椎间盘组织的生物学特性而引起进一步作用,导致椎间盘生物力学性能改变及其细胞合成分泌代谢紊乱。
VanDeursen等[4]发现在持续压应力作用下,牛椎间盘髓核发生蠕变,应力下降,而纤维环应力增高。
Chiu等[5]通过MRI发现,在压应力下椎间盘髓核的脱水程度明显大于纤维环。
陈立等[6]实验研究表明,正常力学环境下,增龄因素对软骨终板蛋白聚糖(proteoglycan,PG)代谢影响较小,PG各组分含量保持相对稳定。
而异常生物力学环境可直接导致终板PG含量不断减少和成分比例改变。
为了阐明和理解脊柱受力与椎间盘退变之间的关系,许多研究者通过施加轴向压力[7]和张力[8]来建立椎间盘退变动物模型。
Lindblom等首次利用弯曲鼠尾的方法建立椎间盘退变模型后,有很多人用该法作实验。
Lotz等[9]将大鼠的尾巴屈曲固定,观察屈曲侧椎间盘的退变情况,结果发现椎间盘损害程度与屈曲的区间有关。
由此推断椎间盘退变可能是一种椎间盘细胞的压迫性萎缩。
Sarver等[10]研究发现,大鼠尾巴椎间盘比腰椎椎间盘有更大的过渡区,以致有更好的弹性力和粘弹性力。
早期对IVDD的研究主要是通过两足鼠完成,因为两足鼠腰椎承受一定的重力,随着年龄增加,腰椎退变加速,神经核脊索细胞在早期即被纤维软骨细胞替代,引起IVDD。
吴靖平等[11]用双后肢普通大鼠建立椎间盘退变动物模型。
在实验中发现,正常老年大鼠髓核中脊索细胞随年龄的增长而逐渐发生退变,双后肢大鼠的退变更严重,髓核细胞的这种退变与人类椎间盘细胞的退变规律完全一致。
截肢法是因为改变脊柱的生物力学致腰椎椎间盘承受较大压力而发生退变。
人类椎间盘承受重力是导致椎间盘退变的因素之一。
故本法所致IVDD的原因和发展规律与人类IVDD有相似,因此不仅适用于进行椎间盘和脊柱退行性疾病的研究,还可以对椎间盘摘除、脊柱融合、椎间盘移植等各种手术引起的变化进行系统的研究,是一种比较经济实用、简单科学的直立动物模型,但它只能适用于小型动物。
脊柱运动节段不稳致椎间盘退变模型采用手术破坏脊柱的一些支持组织(如小关节[12]、棘突等)、一定频率和一定时间内反复刺激脊柱周围的肌肉[13]、椎体内固定和椎间关节融合[14]等手段可使脊柱过度运动,产生脊柱不稳。
研究证明,椎间盘过度反复运动可促发椎间盘退变,如纤维环分层破坏、细胞组织变形和凋亡、骨赘形成等。
运动干扰早期,纤维环周围细胞增殖并分化为类软骨细胞。
如果刺激持续存在,软骨增殖使椎体边缘骨赘增生,碱性成纤维细胞生长因子表达增加。
相对于压迫模型,不稳定模型的应力和细胞效应主要通过纤维环在腰椎屈曲产生,髓核主要是作为一个支点发挥作用。
脊柱运动节段不稳定模型提示,超过生理范围的运动可加速椎间盘由外向内退变,椎间盘周围的高应力可刺激椎体周边骨赘形成和重塑。
这些变化不同于压力模型产生高压力导致椎间盘由内向外的改变,但是长期不稳和长期压力作用对椎间盘最终产生共同的作用途径。
结构模型结构模型分为直接造成椎间盘损伤动物模型和化学方法致椎间盘退变动物模型两种。
直接造成椎间盘损伤动物模型的常用制模方法是通过穿刺造成纤维环和终板损伤,引起急性椎间盘突出和髓核压力降低,启动椎间盘突变的级链反应。
纤维环损伤法Key等(1948)首先应用损伤实验动物后制作动物模型的方法,此后被广泛采用和改进。
Osti等[15]将羊的前外侧纤维环部分切开建立动物模型,并认为在保证纤维环内层未受到损伤的情况下,仅纤维环的外层损伤依然能导致IVDD。
IVDD是一种由外而内的过程,纤维环的外层损伤在椎间盘的退变过程中具有重要作用。
纤维环损伤按部位分为:
前部正中、前外侧、后部正中及后外侧损伤;根据损伤方式分为:
刀割裂伤、纤维环开窗术、针刺伤和刮擦伤。
损伤可分为纤维环的部分或全层,可在椎间盘的中央也可邻近上位或下位终板。
Anderson等[16]和吕浩然等[17]用前侧纤维环切开法来研究正常和退变椎间盘中基因表达的实验,同样证实了该方法的可行性。
与后侧纤维环切开法相比,前侧纤维环切开法具有不破坏脊柱稳定性结构,操作更为简便的优点,但却存在手术创伤大,术后动物难于存活的缺点。
Nguyen等[18]应用髓核抽吸技术,在X线透视下经后外侧入路,对后外侧纤维环行纤维环切开及髓核物质的抽吸,制作了狗的椎间盘退变模型。
Lipson等[19]对兔纤维环的前部刮擦伤后,在一定时间内对椎间盘的生物化学改变进行观察,未发现异常变化。
兔模型椎间盘用11号刀片损伤后很快出现髓核容量丧失,1周内即可引起髓核或纤维环边缘明显变化,1个月即可出现髓核的纤维替代,36周可出现纤维环裂口形成和细胞构成丢失。
以上方法均需形体较大的动物,虽然其创伤小,但由于引起退变所需标准、针刺深度不易掌握,容易造成髓核急性突出,目前很少采用通过穿刺方法制作动物模型。
软骨终板损伤法该法通过椎体钻一斜行的孔洞直达软骨终板和髓核来制作椎间盘退变模型,急性终板损伤引起髓核压力降低和应力重新分布,从而导致椎间盘退变。
Holm等[20]用该法成功建立椎间盘退变模型。
但其破坏终板程度不易掌握,损伤后可立即出现一些变化,如Schmorl结节、局部出血及续发周围肉芽组织形成等而影响观察。
此法创伤较大,有一定死亡率,目前很少用。
化学方法致椎间盘退变动物模型髓核化学溶解术的原理即是通过选择性破坏蛋白多糖以减少椎间盘体积,从而解除椎间盘对相邻神经根的压迫和刺激。
这种治疗已通过在兔或犬的椎间盘内注射木瓜凝乳蛋白酶得到证明,该酶主要作用于髓核中连接长链粘多糖的非胶原蛋白质,使蛋白质发生去集合作用,释放出硫酸软骨素,致使髓核中蛋白质的分子量和粘稠度下降,而对纤维环不发生作用。
适当剂量的木瓜凝乳蛋白酶可导致蛋白快速丢失,椎间盘体积减小,其生物力学发生改变。
在治疗后早期,纤维环层状排列变得松弛,细胞塌陷。
经过一段长期过程后,髓核的蛋白多糖逐渐恢复,直到接近正常的含量和组成。
然而,大剂量木瓜凝乳蛋白酶可能因为固有的蛋白水解作用而引起更加广泛的椎间盘损害,所以在试验过程和临床治疗中须选择理想的治疗剂量[21]。
由于木瓜凝乳蛋白酶的毒性和缺乏基质的特异性,其退变与人类椎间盘退变过程有差别,因此该模型可靠性较差。
现在正在对软骨素酶ABC(CABC)的作用进行评估。
CABC对纤维环和髓核可产生不同的作用效果,并可能与白介素1共同作用于纤维软骨细胞产生的胶原酶。
与木瓜凝乳蛋白酶的作用相似,CABC可引起髓核细胞早期丢失、胶原蛋白容量减少、生物力学功能障碍[22]。
近年有研究[23]发现纤维连接蛋白对人椎间盘退变产生重大影响,其间断注射至兔腰椎间盘内可产生生理退变性动物模型。
与髓核化学溶解术一样,纤维连接蛋白间断注射早期即影响髓核的细胞质和基质。
然而,这些变化较髓核化学溶解术引起的变化更激进,并且不会经过一段时间后得到恢复。
最后髓核被纤维组织替代,纤维环叠层之间出现裂口,外围骨赘形成,整个改变过程类似于人的椎间盘退变。
髓核化学融解术具有在非开放性手术下进行、创伤小、操作简单等优点,其缺点是髓核内注射的药物可影响以后生物化学检测的准确性。
总之,采用纤维环切开法和注射化学酶等方法在家兔、狗、羊等动物上诱导出IVDD模型,其退变原因为纤维环或椎间盘巨大物理化学损伤,与引起人体IVDD的积累性轻微损伤变化不同。
最大缺点是这些模型均为四肢爬行动物,诱导的IVDD未体现最主要的致退变因素――重力作用。
3自发性椎间盘退变模型
Platenberg发现,灵长类动物在大于14岁时即可出现自发性IVDD,影像学检查显示这种改变类似于人椎间盘退变。
Hansen[24]首次报道软骨发育不良犬椎间盘退变情况。
Gillett等[25]对毕格犬的椎间盘研究发现,随着年龄的增大其椎间盘亦发生退变,且组织化学和生物化学的退变征象早于放射学的改变,其退变征象与人类IVDD征象相似。
Moskowitz[26]及Gruber等[27]报道给地中海沙鼠喂养一种标准的实验食物可引起糖尿病和广泛的椎间盘退变,如脊索细胞丢失、终板硬化、纤维环结构破坏、细胞组织变形、周边骨赘形成等,这些形态和细胞的变化与其生物力学改变密切相关。
取这些动物作为动物模型在一定程度上减少了人为因素的影响,可直接对实验对象进行观察。
但这些动物种类和数量有限,价格昂贵,难以大量用于科研活动。
4讨论
动物实验研究的根本在于模型研究结果与人类的相关性,人椎间盘退变后组织结构和细胞学方面发生的变化可通过动物模型模拟出来,这对制定椎间盘退变的预防和治疗策略具有重要意义。
然而,动物模型有其局限性,因为通过动物模型观察的退变过程时间相对较短,在观察过程中很多指标无法监测,并且不能完全模拟人椎间盘退变。
人椎间盘结构重组过程主要基于其多年受损害的长期积累引起的变化。
动物模型和人椎间盘之间的区别不仅应考虑物种的不同,其病因和结果之间关系也可不完全一样,人椎间盘与动物椎间盘之间的最大区别是椎间盘大小和细胞类型不一样。
椎间盘的大小受椎间盘营养需要和生物力学的影响,并影响其生物学进程。
啮齿类动物椎间盘的生物力学特性类似于人类,但这类动物椎间盘面积小,不像人椎间盘需要较多的营养供应,即小动物椎间盘小,需要的营养供给少,不容易发生损伤和退变,容易修复;而人类则相反,椎间盘较大,需要的营养多,损伤后不容易修复。
所以,小动物椎间盘退变模型实际上与人椎间盘退变之间始终存在差距[28]。
大鼠和兔的椎间盘尽管小,但它的MRI检查结果与人椎间盘的反应明显相关,故通过这些动物模型仍可对人椎间盘进行很好的研究[2]。
尽管通过动物模型研究复杂组织中椎间盘退变的因果关系受到多方面限制,但从动物模型中得出的结果对于制定保护机制和治疗策略仍然具有重要作用。
髓核的体积是椎间盘发生退变的本质特点,当其减小时,即促发椎间盘疾病。
维持或重建髓核的渗透机制,保持椎间盘体积,可能是提高临床介入治疗手段的核心。
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