实验四 电泳.docx
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实验四电泳
实验四蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein（1964）和Davis（1964）设计的,样品和浓缩胶中含Tris-HCl（pH6.8）,上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3）,分离胶中含Tris-HCl（pH8.8）。
系统中所有组分都含有0.1%的SDS（Laemmli,1970）。
样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。
此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。
从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。
这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。
由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。
在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。
这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近1：
20时孔径达到最小值。
SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：
29配制，试验表明它能分离大小相差只有3%的蛋白质。
凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。
用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
*丙烯酰胺浓度（%）
线性分离范围（kD）
15
12～43
10
16～68
7.5
36～94
5.0
57～212
*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为1：
29。
1.SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制
⑴试剂
①丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺。
以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N,N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。
这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。
小心：
丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。
②十二烷基硫酸钠（SDS）。
SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液保存于室温。
③用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液。
④TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）。
TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
⑤过硫酸铵。
过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。
须新鲜配制。
⑥Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
⑵装置：
使用不连续缓冲系统要求在垂直板凝胶上进行SDS聚丙烯酰胺电泳。
2．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制
⑴根据厂家说明书安装玻璃板。
⑵确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。
一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液
溶液成分
总体积5ml
总体积10ml
总体积15ml
总体积20ml
总体积25ml
总体积30ml
6%
水
2.6ml
5.3ml
7.9ml
10.6ml
13.2ml
15.9ml
30%丙烯酰胺
1.0ml
2.0ml
3.0ml
4.0ml
5.0ml
6.0ml
1.5MTris（pH8.8）
1.3ml
2.5ml
3.8ml
5.0ml
6.3ml
7.5ml
10%SDS
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
10%过硫酸胺
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
TEMED
0.004ml
0.008ml
0.012ml
0.016ml
0.02ml
0.024ml
8%
水
2.3ml
4.6ml
6.9ml
9.3ml
11.5ml
13.9ml
30%丙烯酰胺
1.3ml
2.7ml
4.0ml
5.3ml
6.7ml
8.0ml
1.5MTris（pH8.8）
1.3ml
2.5ml
3.8ml
5.0ml
6.3ml
7.5ml
10%SDS
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
10%过硫酸胺
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
TEMED
0.003ml
0.006ml
0.009ml
0.012ml
0.015ml
0.018ml
10%
水
1.9ml
4.0ml
5.9ml
7.9ml
9.9ml
11.9ml
30%丙烯酰胺
1.7ml
3.3ml
5.0ml
6.7ml
8.3ml
10.0ml
1.5MTris（pH8.8）
1.3ml
2.5ml
3.8ml
5.0ml
6.3ml
7.5ml
10%SDS
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
10%过硫酸胺
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
TEMED
0.002ml
0.004ml
0.006ml
0.008ml
0.01ml
0.012ml
12%
水
1.6ml
3.3ml
4.9ml
6.6ml
8.2ml
9.9ml
30%丙烯酰胺
2.0ml
4.0ml
6.0ml
8.0ml
10.0ml
12.0ml
1.5MTris（pH8.8）
1.3ml
2.5ml
3.8ml
5.0ml
6.3ml
7.5ml
10%SDS
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
10%过硫酸胺
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
TEMED
0.002ml
0.004ml
0.006ml
0.008ml
0.01ml
0.012ml
15%
水
1.1ml
2.3ml
3.4ml
4.6ml
5.7ml
6.9ml
30%丙烯酰胺
2.5ml
5.0ml
7.5ml
10.0ml
12.5ml
15.0ml
1.5MTris（pH8.8）
1.3ml
2.5ml
3.8ml
5.0ml
6.3ml
7.5ml
10%SDS
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
10%过硫酸胺
0.05ml
0.1ml
0.15ml
0.2ml
0.25ml
0.3ml
TEMED
0.002ml
0.004ml
0.006ml
0.008ml
0.01ml
0.012ml
⑶迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm）。
再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。
⑷分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。
⑸制备浓缩胶：
按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%浓缩胶溶液
溶液成分
总体积3ml
总体积4ml
总体积5ml
总体积6ml
总体积8ml
水
2.1ml
2.7ml
3.4ml
4.1ml
5.5ml
30%丙烯酰胺
0.5ml
0.67ml
0.83ml
1.0ml
1.3ml
1MTris（pH6.8）
0.38ml
0.5ml
0.63ml
0.75ml
1.0ml
10%SDS
0.03ml
0.04ml
0.05ml
0.06ml
0.08ml
10%过硫酸胺
0.03ml
0.04ml
0.05ml
0.06ml
0.08ml
TEMED
0.003ml
0.004ml
0.005ml
0.006ml
0.008ml
⑹聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。
小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
⑺在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:
1体积比加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。
样品处理液配方：
50mMTris-HCl（pH6.8）
100mMDTT（or5%巯基乙醇）
2%SDS
0.1%溴酚蓝
10%甘油
⑻浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。
把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。
必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。
Tris-甘氨酸电极缓冲液：
25mMTris
250mM甘氨酸（pH8.3）
0.1%SDS
⑼按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶）。
⑽将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。
当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。
⑾从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。
紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色
经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。
染色液：
0.1%考马斯亮蓝R250
40%甲醇
10%冰醋酸
染色1～2小时或过夜。
脱色液：
10%甲醇
10%冰醋酸
脱色需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。
此方法检测灵敏度为0.2～1.0μg。
脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。
为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。
4.测量并计算分子量
蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式：
Mw＝K（10－bm）
（1）
lgMw=lgK－bm=K1－bm
（2）
其中Mw是蛋白质分子量；K和K1为常数
b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。
如果用几种标准蛋白质分子量的对数作纵坐标，用各自的相对迁移率作横坐标，即可画出一条斜率为负的标准曲线。
相对迁移率为：
其中，dpr、dBPB分别为样品和BPB（溴酚兰）以分离胶表面为起点迁移的距离。
欲求未知蛋白的分子量，只需求出它的相对迁移率：
mR未=dpr未/dBPB
然后，从标准曲线上就可求出此未知蛋白的分子量。
取出脱色后的凝胶平放在两块透明投影胶片中间，赶尽气泡，在复印机上复印。
在复印的凝胶图上用直尺分别量出各条蛋白带迁移的距离dpr和dBPB（以蛋白带的上沿或中心为准），计算相对迁移率，根据方程式：
lgMw=K1－bmR
用各标准蛋白分子量的对数（纵坐标）和相对迁移率mR（横坐标）画出标准曲线，由标准曲线再求出其他各条待测和未知蛋白带的分子量，如有可能计算其误差。
SDS-PAGE
I.BACKGROUND:
Anionicsurfactantcompoundssuchassodiumdodecylsulfate（SDS）arecomposedofanegativelychargedionic“headgroup”andahydrophobichydrocarbon“tail”.
CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2OSO3–Na+
Thehighsolubilityinwaterimpartedbytheionicheadgroupandthehighsolubilityinnonpolarsolventsimpliedbythehydrocarbontailresultinacompromiseinaqueoussolution.Surfactantmoleculesformaggregatescalledmicellesinaqueoussolution.Theseaggregatessatisfythesolubilitycharacteristicsofboththeheadandtailregionsofthesurfactant;ionicgroupsareexposedtowateronthesurfaceoftheaggregatewhilethehydrophobictailsassociatewitheachotherwithintheinteriorofaroughlysphericalaggregateof60to100molecules.Hydrophobicguestmoleculescanbetakenintotheinteriorofthemicelle.Thisincludesthehydrophobicaminoacidsnormallyconfinedtotheinteriorofanativeprotein.Theassociationbetweenhydrophobicaminoacidresiduesandthemicelleinteriorisstrongenoughtodenaturemostproteins,turningtheminside-outsothatbecomeeffectivelycoatedwithanionicsurfactantmolecules.
Reductivecleavageofall–S-S-bondsfollowedbytreatmentwiththeanionicsurfactantsodiumdodecylsulfate（SDS）willdisruptthenativetertiarystructureofmostproteins,causingthemtoadoptrodlikestructures.Ithasbeenestablishedthatthisbindingoccurswithaconstantsurfactant-totproteinweightratioandwithenoughanionicsurfactantstototallydominatethenativechargeoftheprotein.Therefore,thechargeperunitproteinweightisnearlyconstantandtheelectrophoreticmobilityofSDSdenaturedproteinsisafunctionofsizealone.ThetechniqueofSDS-polyacrylamidegelelectrophoresisiswidelyusedtodeterminethemolecularweightofunknownproteinsbycomparingtheirrelativeelectrophoreticmobilitytostandardproteinsofknownmolecularweight.Adirectcomparisonofthemobilitiesofknownandunknownproteinsrununderidenticalconditions（inthesamecellatthesametime）isrecommended.Themobilitiesofknownproteinscanbeplottedasafunctionoflog（molecularweight）andthemobilitiesofknownproteinsusedtoestimatemolecularweightsbyextrapolation.
AnecessaryfirststepintheproteinsamplepreparationforSDSelectrophoresisistreatmentwithanexcessof2-mercaptoethanol,whichreducesalldisulfide（-S-S-）bondsintheprotein.Thispermitstotaldisruptionoftheproteinnativestructure,whichisusuallystabilizedbydisulfidelinkages.Someproteins（e.g.,chymotrypsin）containpolypeptideslinkedonlybydisulfidebonds.Reductionwillyieldtwoormorepolypeptidefragmentswhichwillmigrateindependently.Inthesamewayoligomericproteins（e.g.,hemoglobin）willdissociateintomonomericsubunitswhensolubilizedbySDS.Forthisreason,hemoglobinmigratesasamonomerofmolecularweight16,000ratherthanatetramerof64,500D.ThesubunitdissociationcausedbySDSisonereasonwhyoligomericproteinsmustbecharacterizedbybothSDSanddiscelectrophoresis.TheporesizeofthegelnetworkisthecriticalfactorinSDS-PAGEseparations.Theaverageporesizecanbedecreasedbyeitherincreasingthetotalconcentrationofmonomer（bothacrylamideandBIS）orbyincreasingtheproportionofcross-linker（BIS）tothetotalmonomerinthegel.Table1givestheapproximatemolecularweightrangesthatcanbeconvenientlyestimatedwithgelsofvarioustotalmonomerconcentrations,expressedaspercent-gel.
%gel=（gAcrylamide+gBIS）/100mlx100
Table1.MOLECULARWEIGHTRANGESFORSDS-PAGE
TotalAcrylamide
（%gel）
15
10
5
M.W.Range
（Kilodaltons）
3-50
10-70
25-200
Thismethodsseparatesproteinsbasedprimarilyontheirmolecularweights（Laemmli,1970）.
Amongthevariedusesofthistechniqueare:
1.Analysisofproteinpurity;
2.Determinationofproteinmolecularweight;
3.Verificationofproteinconcentration;
4.Detectionofproteolysis;
5.Identificationofimmunoprecipitatedproteins;
6.Firststageofimmunoblotting;
7.Detectionofproteinmodification;
8.Separationandconcentrationofproteinantigensforantibodyproduction;
9.Separationofradioactivelylabeledproteins.
Sensitivityofstaining:
1.CoomassieBlue:
0.1~1μgperband（Smith,1984）;
2.SilverStaining:
2~10ngperband（Giulianetal.,1983）.
TimeRequired:
IndividualSteps:
PouringSeparatingGel:
60minutes
PouringStackingGel:
30minutes
LoadingSamples:
15minutes
Electrophoresis:
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