《葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值13C12C测定方法液相色谱联用稳定.docx
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《葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值13C12C测定方法液相色谱联用稳定
《葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值13C/12C测定方法液相色谱联用稳定同位素比值质谱法》行业标准编制说明
一、工作简况
1.任务来源
本项目是根据工业和信息化部行业标准制修订计划（工信厅科[2013]217号），计划编号为2013-1875T-QB，项目名称《葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值13C/12C测定方法液相色谱联用稳定同位素比值质谱法》进行制定，本标准由全国食品发酵标准化中心归口，中国食品发酵工业研究院等单位负责起草。
2.目的和意义
甘油是构成葡萄酒干浸出物的重要成分，是葡萄酒酿造过程中酵母发酵产生的副产物。
甘油对改善葡萄酒甜味、提升葡萄酒的口感具有重要作用，但为保证葡萄酒的产品特性，不论欧盟还是我国均禁止人为地往葡萄酒中添加甘油。
当前国家标准《GB/T15039葡萄酒、果酒通用分析方法》中未涉及甘油的检测方法，难以对葡萄酒中甘油的含量、来源进行有效监管。
国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）为追溯葡萄酒中各成分的来源时广泛采用了先进的稳定同位素比值质谱法，相对于常规检测法，该法技术特异性强，具有较高的应用价值。
甘油稳定碳同位素比值分析方法目前已被OIV（ResolutionOIV/OENO343/2010）采纳为标准方法。
因此，制定我国葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值测定方法对于检测甘油来源、鉴别葡萄酒真实性具有重要意义，有利于维护我国葡萄酒产业的健康发展。
3.简要编制过程
根据工业和信息化部办公厅下达的2013轻工行业标准制定计划，《葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值13C/12C测定方法液相色谱联用稳定同位素比值质谱法》行业标准由中国食品发酵工业研究院牵头组织制定。
起草工作组查阅国际上有关葡萄酒中甘油碳同位素比值测定的文献和标准，通过对测定原理的梳理与理解，分别开发了气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱仪（GC-C-IRMS）和液相色谱-稳定同位素比值质谱仪（LC-IRMS）测定葡萄酒中甘油碳同位素比值的方法，从重复性、稳定性、准确性、可推广性方面进行了验证，进行数理统计与分析，为标准研究提供足够的数据支持，并从中选择液相色谱-稳定同位素比值质谱法为测定葡萄酒甘油稳定碳同位素组成的标准方法。
根据这些据，并结合批准文件中的指标规定，我们编制了葡萄酒中甘油碳同位素比值测定的行业标准初稿。
二、标准编制原则和主要内容
1、标准编制原则
本标准以科学技术和实验数据为依据，经过科学研究而制定。
本标准的制定充分考虑规范行业发展，促进稳定同位素食品分析技术的进步，加强行业监管能力，充分考虑国内相关的法规要求；与相关标准法规协调一致；结合国内分析领域的实际情况，确保标准的科学性、先进性、可操作和可推广性。
本标准起草过程中，主要按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：
标准的结构和编写》和GB/T1.2-2002《标准化工作导则第2部分：
标准中规范性技术要素内容的确定方法》进行编写。
2、主要内容
本标准规定了液相色谱-稳定同位素比值质谱仪测定葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值的方法；
本标准适用于葡萄酒及其他物质中甘油碳同位素比值的测定，连续2次重复测定的标准偏差SD≤0.20‰。
3、主要试验（或验证）情况分析
针对葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值测定方法进行了系统研究，详细的研究数据见附件一。
（1）用气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱法测定葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值，虽然该方法具有较好稳定性，但验证过程中发现葡萄酒中甘油含量会显著影响测定结果，需经过严格校正方可得到甘油的稳定碳同位素比值，该过程增加了分析难度，因此不建议将本法采纳为方法标准。
（2）建立了液相色谱-稳定同位素比值质谱测定葡萄酒中甘油碳稳定同位素比值的方法，并对方法的便利性、稳定性和准确性均进行了验证。
其中连续5次的标准偏差SD≤0.15‰，连续2次测定的SD≤0.3‰，方法的稳定性符合国际要求；利用加标法验证方法的准确性，测定结果与预测值无显著性差异。
4、标准中涉及的专利
无。
五、产业化情况、推广应用论证和预期达到的经济效果等情况
葡萄酒作为世界通畅型酒种，以其健康时尚的文化内涵逐渐被我国消费者认可，作为国家酒类产业“四个转变”政策中大力扶持和发展的酒种，近几年我国葡萄酒产业一直保持良好的发展态势。
2016年全国葡萄酒产量为113.7万升，进口葡萄酒总量约为63.8万千升，同比增长15%。
尽管葡萄酒中本来就含有一定量的甘油，而且食品级甘油是一种合法添加剂，但不论是欧盟还是我国，都禁止人为地往葡萄酒中添加甘油。
但添加外源甘油改善葡萄酒口感和质量的事件时有发生，影响了葡萄酒的品质、声誉，也是葡萄酒行业健康发展的隐患。
制定此项分析方法标准将为葡萄酒行业研究葡萄发酵产生甘油的碳同位素特征、构建葡萄酒的的同位素指纹图谱提供方法参考依据，对规范我国葡萄酒行业有序竞争，防止国外劣质葡萄酒倾销具有重要意义，具有显著社会效益和经济效益。
6、采用国际标准和国外先进标准情况，与国际、国外同类标准水平的对比情况，国内外关键指标对比分析或与测试的国外样品、样机的相关数据对比情况
本标准修改采用了国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）的方法标准：
ResolutionOIV/OENO343/2010：
Methodforthedeterminationofthe13C/12CisotoperatioofglycerolinwinesbyGasChromatographyCombustionorHighperformanceLiquidChromatographycoupledtoIsotopicRatioMassSpectrometry（GC-C-IRMSorHPLC-IRMS）。
七、与现行相关法律、法规、规章及相关标准，特别是强制性标准的协调性
该标准从我国稳定同位素食品分析领域的实际情况出发，参考了国内外相关资料，体现了科学性、先进性和可操作性原则，在制定过程中充分考虑国内相关的法规要求，结合葡萄酒行业的特点，与相关标准法规包括强制性标准协调一致。
八、重大分歧意见的处理经过和依据
无重大分歧意见。
九、标准性质的建议说明
《葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值13C/12C测定方法液相色谱联用稳定同位素比值质谱法》为推荐性行业标准。
十、贯彻标准的要求和措施建议
在本标准通过审核、批准发布之后，由相关部门组织力量对本标准进行宣贯，在行业内进行推广。
建议本标准自发布6个月之后开始实施。
十一、废止现行相关标准的建议
无。
十二、其它应予说明的事项
该标准从我国白酒行业的实际情况出发，参考了国内外相关资料，体现了科学性、先进性和可操作性原则，综合评定达到了国际水平。
《葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值13C/12C测定方法液相色谱联用稳定同位素比值质谱法》
行业标准起草工作组
2017年4月
附件一葡萄酒中甘油稳定碳同位素比值（13C/12C）测定方法
验证
1、研究背景
葡萄酒以其健康时尚的文化内涵逐渐被我国消费者认可，成为酒类行业最具发展空间和潜在消费市场的酒种。
作为国家酒类产业“四个转变”政策中大力扶持和发展的酒种，近几年我国葡萄酒产业一直保持良好的发展态势，已成为全球第五大葡萄酒消费国和第六大葡萄酒生产国，同时我国也是世界第六大葡萄酒进口国。
大力发展我国葡萄酒产业，可大幅提高葡萄种植业的附加值，实现农户增产、增收愿望，符合我国食品产业发展方向和农业产业结构调整需要。
数据显示2016年中国的葡萄酒零售市场价值约为780亿元，全国葡萄酒产量达到了113.7万升。
然而葡萄酒产业快速增长的背后，产品质量问题也层出不穷，“三精一水勾兑的葡萄酒”产业链屡次被央视曝光，葡萄酒产地、年份虚假标注屡禁不止。
尤其是近年来受主流消费者转变、海外直采比重增加和“零关税”政策等因素的影响，进口葡萄酒正快速蚕食过程葡萄酒的市场份额，挤压国产酒的利润空间，但进口葡萄酒的质量安全问题也层出不穷。
葡萄酒产品真实性问题带来了严重的食品安全隐患，破坏了我国葡萄酒产业诚信体系和品牌形象，阻碍了中国葡萄酒产业发展和民族品牌企业的发展，也会导致一系列经济社会安全问题。
甘油是葡萄酒中干浸出物的主要化合物，是酒精发酵的正常副产物。
甘油赋予了葡萄酒酒体丰满的特征--不仅可以增加葡萄酒的甜度，而且使得葡萄酒口感更厚重圆润，因此一些欧洲国家也将甘油作为葡萄酒评级的依据。
然而，葡萄发酵产生的的甘油含量会受葡萄产区的气候、品种与成熟度、酵母菌种与接种量、葡萄含糖量与pH、含氮化合物、SO2添加量、发酵温度等多种因素的影响，有时候由于葡萄质量不好，或者发酵出了问题，会导致生产出来的葡萄酒口感较差，一些不法酒商会人为地往葡萄酒中添加甘油来改善葡萄酒的口感，更有甚者直接用工业甘油和三精一水化学原料生产“葡萄酒”。
但这种非法添加行为在欧盟（EEC）NO.822/87和我国都是被严格禁止的，因此，建立葡萄酒中外源添加甘油的检测方法对葡萄酒质量安全工作具有重要意义。
作为一种C3植物，葡萄及其发酵产物的碳同位素特征不同于C4植物和石化产品，因此可以通过分析甘油的碳同位素特征来检测外源添加的甘油。
2004年，Giovanni等人报道了建立了气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱法（GC-C-IRMS）测定葡萄酒甘油的方法，分析了欧盟部分国家的葡萄酒中甘油碳同位素特征，该方法被国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）采纳为分析葡萄酒甘油碳同位素比值的第一方法（ResolutionOIV/OENO343/2010），该法的分析精度（SD）仅为0.6‰，然而关于各因素对准确分析的影响却未见报道；国内李学民和吴浩等人使用该技术分析了国内葡萄酒的甘油δ13C特征，结果表明该方法的精度可优于0.4‰，但准确性稍差。
2010年，Cabañero使用液相色谱-稳定同位素比值质谱法（LC-IRMS）测定葡萄酒甘油δ13C，精度可优于0.3‰，而准确度方面与GC-C-IRMS比也具有一致性，因此OIV将其作为第二法采纳为方法标准。
本标准制定过程中，鉴于GC-C-IRMS和LC-IRMS能够实现自动进样分析从而提高分析效率、减轻操作人员的压力，因此分别对这两种方法的稳定性、准确性和可推广性方面进行验证。
二、测定原理及主要指标
2.1测定原理
甘油在排除有机物干扰的情况下被转化成CO2气体，经干燥后导入稳定同位素比值质谱仪并测定得出甘油的δ13C值，其分析过程可归结为以下步骤：
2.1.1在确保无同位素分馏或分馏系数可控的条件下，有效分离甘油与其他有机物；
2.1.2将甘油转化成CO2气体；
2.1.3除去大部分水分后将CO2气体导入稳定同位素比值质谱仪的离子源中；
2.1.4将CO2气体转变为电荷为e的阳离子（CO2+），应用纵电场将离子束准直成为一定能量的平行离子束；
2.1.5利用电、磁分析器将离子束分解成不同M/e比值的组分；
2.1.6测定并记录每组离子束的强度；
2.1.7应用计算机程序将离子束强度转化为同位素丰度；
2.1.8将该同位素丰度与测得的工作参考气体的同位素丰度比较，得出δ13C测定值；
2.1.9将该样品甘油的δ13C测定值与参考物质对比得出其真实的稳定碳同位素比值δ13CPDB。
2.2主要指标
2.2.1排除葡萄酒中乙醇、乳酸等有机物的干扰；
2.2.2适用各种浓度范围的含甘油样品；
2.2.3精密度SD，重复性标准偏差r≤0.60‰，再现性标准偏差R≤0.62‰。
三、方法验证
3.1IRMS性能验证
3.1.1IRMS系统的测定稳定性
IRMS系统的性能优劣是确定甘油转化的CO2中碳稳定同位素比值能否被准确的重要指标。
验证IRMS系统的测定稳定性，连续10次通入固定体积的高纯CO2气体，测定CO2中δ13C，结果见表1。
表1IRMS系统的稳定性
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
δ13C
0.043
0.000
-0.033
-0.044
-0.060
-0.081
-0.118
-0.107
-0.132
-0.151
由上表可知，该系统测定CO2中δ13C的标准偏差为0.06‰，符合碳稳定同位素的测定要求。
3.1.2IRMS系统的线性范围
由于IRMS给出样品气的δ13C时需以高纯CO2气体（参考气）为基准，因此确保样品气与高纯CO2气体的进样体积一致是准确测定的关键。
为验证该IRMS系统的线性范围，在连续的8次进样过程中不断增加高纯CO2气体的进样量，并测定，结果见表2。
表2IRMS系统的线性
测定次数
离子强度/V
δ13C
1
0.43
0.10
2
0.76
0
3
2.29
-0.08
4
2.88
-0.12
5
3.87
-0.18
6
4.88
-0.19
7
6.32
-0.16
8
9.86
-0.07
从表2中可以看出，离子流强度范围为0.5~10V时，其总体线性R=-0.03‰/V优于仪器指标±0.066‰/V。
3.2GC-C-IRMS测定甘油δ13C方法研究
3.2.1实验部分
3.2.1.1仪器与试剂
GC-C-IRMS：
DeltaVAdvantage稳定同位素比值质谱仪（美国ThermoFisher公司），配备UltraTraceGC气相色谱与IsoLink接口，以及Triplus自动进样器；
氦气（纯度为99.999%）和二氧化碳气体（纯度99.99%），购于北京北温气体制造厂；
HP-INNOwax气相色谱柱（30m*0.25mm*0.25µm，安捷伦科技（中国）有限公司）；
十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；
乙醇（色谱纯），购于国药集团化学试剂有限公司；
甘油（分析纯），编号为WS-1，WS-2和WS-3，用元素分析仪-稳定同位素比值质谱测得的结果δ13CVPDB分别为-30.98±0.05‰、-27.95±0.04‰和-25.08±0.04‰（结果以IAEA-CH-6和IAEA-601进行数据校正）。
3.2.1.2样品准备
WS-1，WS-2和WS-3分别用乙醇稀释至约6g/L。
WS-1和WS-3分别用不同含水量（20%~100%）的乙醇水溶液稀释至5g/L。
葡萄酒样品（wine-01）经0.22µm水系滤膜过滤。
3.2.1.3仪器条件
GC条件进样量1μL，进样口温度270℃，载气为氦气，流速1.2mL/min，分离比10:
1。
程序升温条件为：
初温120℃，升温速度为25℃/min。
甘油转化条件燃烧转化装置（IsoLink）中配备陶瓷（Al2O3）氧化管（填料为CuO，NiO和Pt），工作温度为1000℃；
3.2.1.4数据处理
Thermoisodatversion3.0软件用于数据采集和碳同位素值的计算。
3.2.2结果与讨论
气相色谱适合对低沸点物质进行分离和分析，然而常压下甘油的沸点是290℃，在205℃或稍高温度时会随受热时间而有不同程度的聚合和分解。
OIV方法中进样口温度设定为270℃，并采用分流进样模式，在该条件下有部分甘油未进入色谱柱，因而必然会发生碳同位素动力学分馏。
根据稳定同位素分析领域的“IT”原则，只要标准物质和样品在同样的体系下进行分析，则可以通过后期校正得到准确结果而不必担心分馏的影响。
但是，项目组在应用OIV的GC-C-IRMS方法进行样品分析时发现其存在一些问题：
葡萄酒样品用乙醇稀释4倍后取0.3μL进样（分流比120:
1）测定，却未能监测到甘油的色谱峰，为此，我们针对样品的不同属性进行了方法验证。
3.2.2.1进样口温度对甘油测定的影响
气化是GC分离甘油及其他有机物的第一步。
研究进样口温度对甘油δ13C测定的影响：
保持色谱柱240℃恒温，并设定IsoLink的反吹阀（Backflushvalve）在0~300s处于打开状态以防止乙醇进入反应管。
以甘油乙醇溶液（WS-1、WS-2、WS-3）和葡萄酒（W-01）为研究对象，分别在进样口温度200℃、240℃、270℃和300℃时进样，每个试样进样3次，甘油经GC-C-IRMS转化的CO2的信号强度（m/z44）见图1，δ13C结果见表1。
图1不同进样口温度时甘油转化的CO2的信号强度（m/z44）
表3甘油在不同进样温度下的δ13C测定结果（‰）
进样口温度
200℃
240℃
270℃
300℃
WS-1
-27.63±0.14
-27.45±0.10
-27.80±0.10
-27.83±0.16
WS-2
-24.33±0.18
-24.04±0.18
-24.15±0.13
-23.64±0.22
WS-3
-21.11±0.28
-20.85±0.21
-20.88±0.17
-20.49±0.24
Wine-01
-24.13±0.09
-24.05±0.20
-23.96±0.19
-23.84±0.04
Δ13C（WS-2）-（WS-1）
3.30
3.51
3.65
4.01
Δ13C（WS-3）-（WS-1）
6.43
6.70
6.92
7.34
从图1可出，GC-C-IRMS分析甘油碳同位素组成时，甘油产生的CO2的信号强度（m/z44）因进样口温度不同而有差异：
三个甘油标品均溶于纯乙醇中，在240℃时信号强度达到最大值，在240℃到270℃时无变化，然而葡萄酒样品的甘油信号强度却只在270℃时呈现出最大值；进样口温度高于270℃时甘油信号强度降低，可能是由于温度太高导致甘油分解，或者是乙醇、水等其他低沸点物质的蒸汽分压太大，270℃时甘油的气化占比变小，进入色谱柱的比例也因之降低的缘故。
对比不同进样口温度时的δ13C结果可知：
200~270℃时δ13C测定结果无明显差异（极差＜0.3‰），但300℃时呈现出偏正的趋势，而分析精度普遍在0.04‰~0.3‰之间。
考虑到葡萄酒样品（Wine-01）在270℃时的具有更高的信号强度（m/z44），后续研究中均设定进样口温度为270℃。
需要注意的是，WS-1、WS-2和WS-3的δ13CVPDB分别为-30.98±0.05‰、-27.95±0.04‰和-25.08±0.04‰，而200~270℃时三个标样的δ13C实测均值分别为-27.63±0.17‰、-24.17±0.15‰和-20.95±0.14‰，测定值与给定值之间的系统偏差分别为3.35‰、3.78‰和4.13‰，这说明单纯依靠调整工作参考气CO2的赋予值来计算样品的δ13CVPDB值是不充分的，而应该需遵守稳定同位素分析的“IT”原则，并依据Stephen等建立的数据模型来校正：
三个标样的测定值与给定值之间的线性拟合程度R2=1，这说明该分析条件（进样口270℃、色谱柱240℃恒温、分流进样10:
1）下甘油碳同位素分馏特征是线性的、分馏系数是固定的，因此可以采用两点校正法，任取两个标样的测定值和给定值建立回归曲线，如WS-1和WS-2之间的线性拟合公式为δ13CVPDB=0.8832*δ13C-6.5792，由此计算得出WS-2的δ13CVPDB值为-27.93‰，与给定值-27.95‰十分接近。
3.2.2.2柱温对甘油测定的影响
如上文所述，分流进样模式下进样口温度影响样品的气化特征进而影响甘油产生的CO2的信号强度，同样地，GC-C-IRMS体系中毛细色谱柱并非直接连在检测器上，色谱柱流出的物质约有90%的物质转入燃烧管中（其余10%经裂解管排出）。
甘油在该节点处并未100%进入燃烧管，因此可能因样品损失而出现碳同位素分馏。
为验证色谱柱温度对甘油δ13C测定的影响，在进样口温度270℃、载气流速1.2mL/min的情况下，设定程序升温的初始温度为80℃，保持1min，然后以30℃/min的速度升至180℃、200℃、220℃、240℃或260℃，并分别保持恒温至分析结束。
甘油乙醇溶液（WS-1、WS-2、WS-3）和葡萄酒（W-01）分别进样，每个试样进样3次，甘油经GC-C-IRMS转化的CO2的信号强度（m/z44）见图2，δ13C结果见表2。
图2不同色谱柱最终温度时甘油转化的CO2的信号强度（m/z44）
表4甘油在不同色谱柱温度下的δ13C测定结果（‰）
色谱柱终温
180℃
200℃
220℃
240℃
260℃
WS-1
-22.79±0.28
-24.20±0.87
-26.66±0.72
-27.55±0.22
-28.70±0.06
WS-2
-17.67±0.94
-20.51±0.81
-21.76±0.41
-23.36±0.17
-24.99±0.25
WS-3
-11.95±1.72
-18.02±0.29
-18.72±0.11
-20.11±0.08
-21.86±0.09
Wine-01
-17.72±1.36
-23.33±0.17
-23.15±0.06
-23.73±0.09
-24.12±0.15
Δ13C（WS-2）-（WS-1）
5.12
3.68
4.90
4.19
3.71
Δ13C（WS-3）-（WS-1）
10.84
6.17
7.94
7.44
6.84
图2中，各试样中甘油转化的CO2信号强度（m/z44）随色谱柱最终温度的升高而增加，最大相差近4倍，这表明柱温影响了甘油流出色谱柱后的分配情况，温度越高，越有利于甘油进入燃烧管。
表4中，180℃~220℃时甘油δ13C测定值的标准偏差较大（＞0.4‰），分析其原因，可能是由于甘油的沸点较高，甘油流出色谱柱后或在色谱柱中有一部分被液化的缘故。
根据同位素热力学分馏原理，我们知道温度越高时同位素越能快速达到动态平衡，甘油在柱温180℃和200℃时流入反应管的部分与剩余部分可能未达到平衡状态，因此导致碳同位素测定精度差。
240℃和260℃时甘油δ13C的测定重复性均比较理想（标准偏差小于0.25‰），相对于240℃，柱温设定在260℃时甘油标品（乙醇为溶剂）产生的CO2的信号强度（m/z44）提升有限（2%~5%），而葡萄酒样品中甘油的信号强度（m/z44）提高了约9%，这表面260℃的柱温条件对含水试样较为有利。
稳定同位素分析领域，分析系统测定尺度（“scale”）对分析准确性至关重要[23]，由于稳定同位素分析误差的存在（δ13C≤0.3‰），我们认为，测定尺度越大，分析误差对样品准确性的影响越小（比如针对两个物质的测定尺度：
实际差值=2，即使分析误差为0.3‰，那么数据经校正后结果的误差则可能仅为0.15‰）。
标品WS-1与WS-3之间δ13CVPDB差值为5.80‰，180℃和220℃时差值最大，但分析精度差；与260℃的数据相比，240℃时两标样测定值的差异更大一些，因此选择尽管260℃更有利于提升含水试样中甘油信号量，但选择240℃作为后续研究的色谱柱的最终温度。
3.2.2.3水分对甘油测定的影响
上文研究过程中，葡萄酒和甘油-乙醇溶液在测定时表现出了一些不同，其原因可能是由于样品中溶剂不同导致的：
纯甘油样品的溶剂为纯乙醇，而葡萄酒中则是10%左右的乙醇水溶液。
为研究水分对甘油测定的影响，分别配制含水量为0、20%、40%、60%、80%、90%和100%的乙醇水溶液，配制约100g/L
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