HIV药代动力学.docx
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HIV药代动力学
体外释药动力学研究-紫外分光光度
（1-；4-；5-；6-；8-；）体外释放研究方法包括：
动态膜透析法；水平扩散池法；渗析扩散技术；反相渗析技术；超速离心法；超滤法；离心超滤技术等。
检测波长的确定
称取原料药适量，并用适当的稀释液稀释成适当的浓度，稀释液为空白，在200~400nm波长范围内扫描，观察其吸收峰，从而确定检测波长；
释放介质的选择
分别考察其在不同释放介质（水、盐酸、PBS、KCl和NaCl）中的体外释药特征。
在各个释放介质中的释药参数
1、标准曲线的测定
将标准品用不同的释放介质等比稀释成适当浓度的标准溶液，以吸收度A对浓度C进行线性回归处理，得浓度与吸光度的线性回归方程。
介质
方程
相关系数
水
PBS
盐酸
KCl
NaCl
2、精密度实验
精密称取标准品适量，用各释放介质配制低、中、高（）三种浓度标准溶液，按上述方法测定吸收度A。
一天内测定5次计算日内精密度；每天测定一次，连续测定五天，计算日间精密度。
3、回收率实验
精密量取标准溶液适量，用各释放介质配制低、中、高（）三种浓度标准溶液，按上述方法测定吸收度A，计算回收率。
4、累积释药百分率测定
1）精密称取适量药物，照中国药典2005版二部附录XD第二法操作，在各个释放介质中，转速100r/min，按预定时间每次取样5mL，立即补加等量同质释放介质，在？
？
nm下测定吸光度，代入标准曲线计算药物的释放百分率（Q）。
并将各组数据两两组合计算f2（相似因子值），比较其体外释药行为。
其中，n指溶出的时间点，Rt和Tt分别为参比和供试制剂在t时间点的累积溶出度，w为权重系数（设为1）。
2）采用动态膜透析法进行体外释药实验。
精密量取5mg样品置于透析袋中，将含药透析袋置于100ml释放介质中，温度为37±0.5℃，转速为100r／min，分别于0．5、1、2、4、6、8、12、24、36、60h定时从袋外缓冲液中取出3ml，立即补加等量同质释放介质。
以磷酸缓冲液（pH6．8）为空白，于？
？
nm处测吸收度A，计算累计释放百分率（Q）。
5、在各个释放介质中释药动力学分析
将样品的释药行为进行释药数学模型拟合，拟合优度和数学释放模型（8-）
药品
类型
方程式
相关系数
样品
零级动力学方程
一级动力学方程
Higuchi方程
Weibull方程
体内药代动力学实验-高效液相色谱法
药物在体内的吸收及分布（1-；2-；3-；15-；16-；17-；）
药时曲线
药代动力学参数：
根据试验中测得的各受试动物的血药浓度-时间数据，求得受试物的主要药代动力学参数。
静脉注射给药，应提供t1/2（消除半衰期）、Vd（表观分布容积）、AUC（血药浓度-时间曲线下面积）、CL（清除率）等参数值；血管外给药，除提供上述参数外, 尚应提供Cmax和Tmax（达峰时间）等参数，以反映药物吸收的规律。
另外，提供统计矩参数，如:
MRT（平均滞留时间）、AUC（0-t）和AUC（0-∞）等，对于描述药物药代动力学特征也是有意义的。
受试动物
小鼠，雌雄各半，体重20±2g，购买后适应性饲养48h。
给药前12h禁食不禁水，以排除食物对药物吸收的影响。
溶液配制方案
1、小鼠口服给药溶液 准确称取样品适量，溶入生理盐水（或DMSO）。
2、小鼠静脉注射给药溶液 同上
3、对照品溶液精密称取样品原料药10mg，置于100mL容量瓶中，加流动相配成浓度为100μg?
mL-1的储备液，再将储备液用流动相稀释为10、25、50、250、500、1000、和2500ng?
mL-1系列标准对照溶液，置4℃冰箱内保存待用。
4、内标溶液 精密称取标准品5mg，置于100mL容量瓶中配成浓度为50μg?
mL-1的储备液；用流动相稀释成浓度为25μg?
mL-1的内标溶液，置4℃冰箱内保存待用。
给药方案
为保证最佳采样点，在正式试验前，选择2~3只动物进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。
给药前需要采血作为空白样品。
为获得给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相（峰浓度附近）和消除相。
一般在吸收相至少需要2~3个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度（Cmax）；在Cmax附近至少需要3个采样点；消除相需要4~6个采样点。
整个采样时间至少应持续到3~5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。
1、单次给药
口服：
给小鼠灌胃样品溶液，并与给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10h，眼球取血，置于肝素化离心管中，3000r?
min-1离心分离取上清血浆，于-20℃冰箱中保存待测。
静脉注射：
给小鼠静脉注射样品溶液，并与给药后0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10h，眼球取血，置于肝素化离心管中，3000r?
min-1离心分离取上清血浆，于-20℃冰箱中保存待测。
对血浆样品的测定按“血浆样品预处理”项下操作，每日建立一条标准曲线，同时分析低、中、高（双样本）的质控样品，根据当日标准曲线计算各取样时间点的样品浓度和质控样品浓度，质控样品的相对偏差在±15%之内时，当日数据方可接受。
2、多次给药
口服：
连续5日给小鼠灌胃样品溶液，并于第1日，第5日分别采血（采样时间点为给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10h）。
眼球取血，3000r?
min-1离心分离取上清血浆，于-20℃冰箱中保存待测。
静脉注射：
同上
注：
多次给药需测定以下参数：
各个（和各组）受试动物首次给药后的血药浓度-时间数据及曲线和主要药代动力学参数。
各个（和各组）受试动物的3次稳态谷浓度数据及平均值、标准差。
各个（和各组）受试动物血药浓度达稳态后末次给药的血药浓度-时间数据和曲线，及其平均值、标准差和曲线。
比较首次与末次给药的血药浓度-时间曲线和有关参数。
各个（和各组） 平均稳态血药浓度及标准差。
色谱条件
样品的采集、保存及预处理
1、血浆样品的采集、保存及预处理（7-；2-；）
眼眶取血，肝素抗凝，3000r?
min-1离心分离取上清血浆，于-20℃冰箱中保存待测。
离心管中依次加血浆样品200μL（对于浓度超出线性范围的样品，先用空白血浆稀释），水200μL，流动相100μL，内标溶液50μL，磷酸盐缓冲液（pH7.4）200μL，旋涡1min，旋涡3min，在3000r?
min-1下离心10min，取上清液，在40℃水浴中，氮气流吹干，再加入200μL流动相溶解，漩涡1min，取20μL样品进样。
2、组织样品的采集、保存及预处理（15-；）
分别于给药后O．17，0．5，1．0，3．5h取血后处死，立即解剖采集脑、心、肺、肝、脾、肾、卵巢（睾丸、附睾）等组织，组织用生理盐水冲净表面残留血液及内容物后，称重，-20℃冷冻保存。
分别取各组织加入1mL水匀浆，3000r?
min-1离心分离取上清。
离心管中依次加组织样品200μL，水200μL，流动相100μL，内标溶液50μL，磷酸盐缓冲液（pH7.4）200μL，旋涡3min，在3000r?
min-1下离心10min，取上清液，在40℃水浴中，氮气流吹干，再加入200μL流动相溶解，漩涡1min，取20μL样品进样。
方法的专属性
1、空白血浆、空白血浆外加样品、空白血浆外加样品和内标、给药后血浆样品外加内标按“血浆样品预处理”项下方法操作处理后色谱图。
检测血浆中的内源性杂质是否干扰药物及内标的测定。
取空白血清，除不加内标溶液并另外补加50μL流动相外，其余按“血清样品的处理”项下方法操作，获得空白样品的色谱图；将对照品系列溶液（相当血清浓度分别为2，2．5．2．5ng／mL）和内标溶液（200ng／mL）加入空白血清中，依同法操作，获得相应的色谱图；同法处理，得到小鼠给药后血清样品色谱图。
（（1-；）精密量取标准储备液lml置10ml容量瓶中，加流动相稀释定容，配成浓度约为1μg／ml的溶液，进样20μL，；取小鼠空白血浆，按血浆样品处理方法处理，进样20μL，得小鼠空白血浆色谱图，将一定量的标准储备液加入到小鼠空白血浆中，同法操作，得对照品色谱图。
）
2、取空白组织匀浆上清液，除不加内标溶液外，其余按“组织样品的处理”项下方法操作，获得空白样品的色谱图；将对照品系列溶液和内标溶液加入空白组织样品中，依同法操作，获得相应的色谱图；同法处理，得到小鼠给药后组织样品色谱。
检测组织中内源性物质是否干扰样品和内标的测定。
最低检测限
采用信号与噪音比方法，以？
？
nm为检测波长，把一系列已知低浓度标准品血样溶液与空白血样溶液处理后，分别进样20μL，记录色谱图。
把此系列AZT标准品血样溶液的信号与空白血样的信号进行对比，以信号／噪音=3：
1时的浓度为最低检测限，得最低检测限。
标准曲线（7-；）
1、小鼠血浆标准曲线的建立
取空白血浆200μL，加入标准系列溶液50μL，除不加100μL流动相外，其他按“血浆样品预处理”项下方法操作。
在分析方法建立阶段，每个浓度平行进行3个样本的分析，重复三个分析批；分别以生物样品中待测物（ART）的浓度（C）为横坐标，以ART与内标IS的峰面积比（R）为纵坐标，得直线回归方程，即为标准曲线。
ART的线性范围为2-500ng?
mL-1，质谱响应的线性关系良好。
2、小鼠组织器官标准曲线的建立
取空白组织匀浆上清液200μL，加入对照品系列溶液50μL，配制相当于浓度为5，20，50，100，200，500，1000ng／mL的组织样品，按“组织样品的处理”项下操作，建立标准曲线，以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物色谱图的峰面积比值为纵坐标，记录色谱图，求得峰面积A；以峰面积A对浓度C进行线性回归处理，得回归方程。
精密度及准确度（相对回收率）试验
1、小鼠血浆精密度实验
取空白小鼠血浆100μL，根据血浆标准曲线线性范围，按“血浆样品预处理”方法配制低、中、高3个质量浓度的样品，进行6个样品分析，连续测定3d，用当日标准曲线计算样品的质量浓度，从而考察方法的日内精密度（RSD）和准确度（RE）。
代入当天的标准曲线求出其
实测浓度，计算实测浓度的RSD值，即为日间RSD。
第一天处理后的样品于日内4h、6h、8h测定，同日间RSD求算方法算得日内RSD值。
要求日内及日间精密度数值的RSD在4-15％范围内。
准确度是通过计算测定浓度与初始浓度的符合程度来评价系统偏差的，要求回收率在85％一115％之间。
相对回收率=测得量/加入量*100%
2、小鼠组织器官精密度实验
取空白小鼠组织匀浆200μL，根据组织标准曲线线性范围，按“组织样品预处理”方法配制低、中、高3个质量浓度的样品，进行6个样品分析，连续测定3d，用当日标准曲线计算样品的质量浓度，从而考察方法的日内精密度（RSD）和准确度（RE）。
要求日内及日间精密度数值的RSD在4-15％范围内。
准确度是通过计算测定浓度与初始浓度的符合程度来评价系统偏差的，要求回收率在85％一115％之间。
提取回收率实验（绝对回收率）
1、小鼠血浆提取回收率实验
取低、中、高3个浓度的标准系列溶液，按“标准曲线的制备”项下操作，以空白血清提取前加入标准溶液和提取后加入标准溶液所获得的色谱峰面积之比，考察样品的提取回
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