盐酸吉西他滨降解实验研究.docx

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盐酸吉西他滨降解实验研究

摘要

目的研究抗肿瘤药物盐酸吉西他滨降解趋势。

方法用盐酸吉西他滨USP含量和杂质检测方法来检测盐酸吉西他滨在酸，碱，避光，光照，氧化，高温，高湿条件下的稳定性及降解趋势。

结果与结论盐酸吉西他滨在氧化条件下是不稳定的。

在光照条件下是很不稳定性。

在碱降解条件下不是很稳定。

在酸降解，高温降解，高湿降解，避光条件下相对稳定。

关键字：

盐酸吉西他滨，降解，稳定性，抗肿瘤药物。

一、文献综述

（一）盐酸吉西他滨的化学名和药理作用及药代动力学

盐酸吉西他滨英文名为GemcitabineHydrochloride。

化学名为：

4-氨基-1-（3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基）-1H-嘧啶-2-酮盐酸盐。

盐酸吉西他滨作为一种前药在细胞内是脱氧胸苷激酶磷酸化的良好底物，在酶的作用下转化成下列代谢物：

吉西他滨一磷酸盐（dFdCMP）、吉西他滨二磷酸盐（dFdCDP）和吉西他滨三磷酸盐（dFdCTP）其中dFdCDP和dFdCTP为活性产物。

dFdCDP抑制核糖核苷酸还原酶，从而减少了DNA合成的修复所需的脱氧核苷酸的量（尤其是dCTP），低水平的dCTP逆转了脱氧苷激酶正常的负反馈抑制，导致dFdCTP更多的积聚。

同时dFdCDP抑制了dCTP诱导的脱氧胞氨酶对dFdCMP的脱氨作用，且dFdCTP直接抑制脱氧胞苷脱酶，从而使更多的dFdCMP转化成活性代谢物dFdCMP的脱氨作用，且dFdCTP直接抑制脱氧胞苷脱氨酶，从而使更多的dFdCMP转化成活性代谢物dFdCDP，dFd-CTP而dFdCTP则与dCTP竞争结合进入DNA链，插入至DNA链中脱氧胞苷的位点，并允许鸟苷与其配对,盐酸吉西他滨分子就被此鸟苷“掩蔽”使其免受核糖核酸外切酶的移除修复，然后DNA链合成停止，进而DNA断裂、细胞死亡。

盐酸吉西他滨在静注后，很快的分布到全身各组织，输注时间越长，就越广，越深入，半衰期也就越长。

在短时间输注下，半衰期约为32min~94min,在结束输注5min内，本品血浆浓度为3.2~45.5ug/ml,本品仅有少数与蛋白质结合，能被胞苷脱氨酸在肝脏，肾，血液和其他组织中快速完全的代谢，只有不到10%原药与代谢物从尿中排泄。

（二）药品稳定性研究的重要性

药品作为一种特殊的商品，它特殊性主要表现在专属性、两重性、质量的重要性和稳定性。

药品质量的优劣性直接关系到用药者的健康与生命安全。

因此，必须对药品质量实行全面的控制，以确保人们用药的安全、合理和有效。

（三）盐酸吉西他滨稳定性研究的方法

为确保药品质量稳定性、安全性和有效性，参考各文献及海正内部的标准操作程序开展降解实验。

使用DAD检测器对主峰纯度进行分析。

说明在主峰中、各降解产物峰中有没有包含其它峰,其重要性体现在：

一可以了解降解产物的特性；二是可以有效地检出和控制杂质。

判断此方法是否适用于降解杂质的检测，是否具有稳定性指示性；同时探索盐酸吉西他滨在经过酸，碱，高温，氧化，光照，避光等条件下的稳定性特性，如降解途径，降解机制；鉴别和制备降解产物；探索盐酸吉西他滨在储藏过程中可能遇到的剧烈条件下的降解趋势；还可以为样品的包装及储存条件的选择提供依据。

二、实验部分

（一）实验仪器和试剂

电子分析天平：

MettlerXP205

高效液相色谱仪：

Agilent1100

色谱柱信息

AgilentZORBAXSB-C8

250*4.6mm5µm

货号：

880975-906

实验室ID：

F0134

水：

纯化水，当日有效

来源：

海正药业制备

甲醇

批号：

I589107119

来源：

Merck

磷酸：

批号：

T20101202

来源：

国药集团化学试剂有限公司

双氧水

批号：

20100517

来源：

国药集团化学试剂有限公司

磷酸二氢钠：

批号：

F20110524

来源：

国药集团化学试剂有限公司

盐酸吉西他滨标准品：

批号及含量：

HOI10199.8%

来源：

USP

胞嘧啶：

批号及含量：

115k174285.5%

来源：

Sigma

（二）盐酸吉西他滨HPLC降解实验方法的建立

通过研究盐酸吉西他滨在酸，碱，加热，光照，氧化，高温，高湿条件下的稳定性，探索盐酸吉西他滨在这些条件下可能的降解趋势。

1、方法描述

[含量]

1　色谱系统

流动相：

取13.8g磷酸二氢钠、2.5ml磷酸加1000ml水混合，此溶液pH为2.4～2.6。

色谱柱：

Agilent，ZORBAXSB-C8，5µm，4.6mm×250mm或者相当

检测波长：

275nm

流速：

1.2ml/min

进样量：

20µl

2　溶液配制

标准溶液：

取盐酸吉西他滨对照品25mg，加水溶解并稀释制成250ml溶液。

样品溶液：

取盐酸吉西他滨样品25mg，加水溶解并稀释制成250ml溶液。

系统适用性溶液：

取盐酸吉西他滨约10mg，置一小容器中，加0.168g/ml的氢氧化钾甲醇溶液4ml，加盖紧闭，超声，并于55℃加热6至16小时，冷却，用1%（V/V）的磷酸溶液淋洗移至100ml量瓶中，加1%（V/V）的磷酸溶液稀释至刻度，混匀（此溶液中а－异构体浓度约为0.02mg/ml）。

3　系统适应性及操作步骤

进样溶剂、系统适应性溶液各1针，连续进样标准溶液5针，系统适用性溶液色谱图中а－异构体与吉西他滨的分离度应不低于8.0；吉西他滨的拖尾因子不得过1.5；对照品溶液色谱图中重复进样的标准偏差不得过1.0%。

按下式计算湿计（C9H11F2N3O4·HCl）湿计含量

（PCs/Cu）（ru/rs）

式中：

Cu，Cs分别是样品溶液与标准溶液中的盐酸吉西他滨配制浓度（mg/ml）

ru，rs分别是样品溶液与标准溶液所得的峰响应值

P为盐酸吉西他滨对照品的含量，%

[相关物质]

1　色谱系统

流动相：

溶液A－含量项下的流动相；溶液B－甲醇，梯度如下：

时间（分钟）

溶液A（%）

溶液B（%）

色谱柱、检测波长、流速、进样量见含量项下。

2　溶液配制

系统适应性溶液见含量项下。

对照品溶液：

取盐酸吉西他滨对照品及胞嘧啶对照品，精密称定，加水溶解并稀释制成分别为每1ml各含2µg的溶液（例如：

20mg→100ml，1.0ml→100ml）。

样品溶液：

取盐酸吉西他滨样品50mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度摇匀。

3　系统适应性及操作步骤

进样溶剂、系统适应性溶液各1针，连续进样对照品溶液6针，系统适用性溶液色谱图中а－异构体与吉西他滨的分离度应不低于8.0；吉西他滨的拖尾因子不得过1.5；对照品溶液色谱图中重复进样的标准偏差不得过2.0%。

a.按下式计算胞嘧啶含量：

P（Cc/CU）（ri/rs）

式中：

CC为对照品溶液中胞嘧啶的浓度（mg/ml）；

CU为样品溶液中胞嘧啶的配置浓度（mg/ml）；

ri，rs分别是样品溶液与对照品溶液所得溶液的胞嘧啶峰响应值；

P为胞嘧啶对照品的含量%

b.用下式计算除胞嘧啶之外的其它杂质（а－异构体，其它单个杂质，总杂质）：

（PCS/CU）（ri/rs）

式中：

CU为样品溶液的盐酸吉西他滨配置浓度（mg/ml）；

CS是对照品溶液中盐酸吉西他滨的配置浓度（mg/ml）；

ri为样品溶液所得的各杂质的峰响应值；

rs为对照品溶液中盐酸吉西他滨的峰响应值；

P为盐酸吉西他滨对照品的含量%

（三）盐酸吉西他滨HPLC降解实验的操作步骤

1、含量

按照上述含量方法配置标准溶液，当色谱系统平衡后，分别进溶剂、系统适用性溶液各一针，连续进样5针标准溶液，计算RSD%，结果见表1。

表1.系统适应性结果

序号

峰面积

4003.30811

3999.86597

4002.62573

4009.72217

4004.82397

平均值

4004.06919

RSD（%）

0.09

拖尾因子

1.1

分离度

14.9

接受标准

R≥8.0T≤1.5RSD≤1.0%

标准溶液：

称取盐酸吉西他滨标准品（25.01mg、20.06mg）分别至25ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密移取5ml至50ml容量瓶中，加水稀释至刻度。

作为STD1溶液和STD2溶液。

系统适用性溶液：

取盐酸吉西他滨约10mg，置一小容器中，加0.168g/ml的氢氧化钾甲醇溶液4ml加盖紧闭，超声，并于55℃加热6至16小时，冷却，用1%（V/V）的磷酸溶液淋洗移至100ml量瓶中，加1%（V/V）的磷酸溶液稀释至刻度，混匀。

1　原样

精密移取杂质项下盐酸吉西他滨原样样品5.0ml到100ml容量瓶中，加水溶解并稀释到刻度。

待系统稳定后，进样1针，记录色谱图。

用DAD检测器测定样品溶液峰纯度。

2　热降解

精密移取杂质项下热降解盐酸吉西他滨样品5.0ml到100ml容量瓶中，加水溶解并稀释到刻度。

待系统稳定后，进样1针，记录色谱图。

用DAD检测器测定样品溶液峰纯度。

3　光降解

精密移取杂质项下光降解盐酸吉西他滨样品5.0ml至100ml容量瓶中，加水溶解并稀释到刻度。

待系统稳定后，进样1针，记录色谱图。

用DAD检测器测定样品溶液峰纯度。

4　避光样品

精密移取杂质项下避光盐酸吉西他滨样品5.0ml至100ml容量瓶中，加水溶解并稀释到刻度。

待系统稳定后，进样1针，记录色谱图。

用DAD检测器测定样品溶液峰纯度。

5　氧化

分别精密移取杂质项下各氧化盐酸吉西他滨样品5.0ml至100ml容量瓶中，加水溶解并稀释到刻度。

待系统稳定后，各进样1针，记录色谱图。

用DAD检测器测定样品溶液峰纯度。

6　酸降解

分别精密移取杂质项下酸降解盐酸吉西他滨样品5.0ml至100ml容量瓶中，加水溶解并稀释到刻度。

待系统稳定后，各进样1针，记录色谱图。

用DAD检测器测定样品溶液峰纯度。

7　碱降解

分别精密移取杂质项下碱降解盐酸吉西他滨样品5.0ml至100ml容量瓶中，加水溶解并稀释到刻度。

待系统稳定后，各进样1针，记录色谱图。

用DAD检测器测定样品溶液峰纯度。

8　高湿（80%）

精密移取杂质项下高湿降解盐酸吉西他滨样品5.0ml至100ml容量瓶中，加水溶解并稀释到刻度。

待系统稳定后，进样1针，记录色谱图。

用DAD检测器测定样品溶液峰纯度。

2、相关物质

按照上述相关物质方法配置标准溶液，当色谱系统平衡后，分别进溶剂、系统适用性溶液各一针，连续进样6针对照品溶液，结果见表2。

表2.系统适应性结果

序号

吉西他滨峰面积

胞嘧啶峰面积

1st

80.61019

159.26308

2nd

80.25953

152.07422

3rd

80.86729

151.90688

4th

80.2511

152.01169

5th

79.79696

152.41159

6th

80.23566

152.69746

平均值

80.33678

153.39415

RSD（%）

0.46

1.88

拖尾因子

1.0

分离度

11.9

接受标准

R≥8.0T≤1.5RSD≤2.0%

对照品溶液：

称取盐酸吉西他滨对照品20.07mg及胞嘧啶对照品20.03mg各20mg至25ml容量瓶中，加水溶解稀释至刻度，精密移取1ml到100ml加水稀释至刻度。

1　原样

称取盐酸吉西他滨样品（50.3mg，50.2mg），分别于25ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

2　热降解

称取约0.2g样品，置于105℃的烘箱中放置24小时，取出，置于干燥器中冷却至室温。

准确称取50.1mg样品，置于25ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

3　光降解

取约0.2g样品，平摊放入平皿中，600wa/m2光照箱内光照24小时后取出，置于干燥器中。

准确称取50mg样品，置于25ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

4　避光样品

取约0.2g样品，平摊放入平皿中，外置一黑色PE袋，外加一铝箔袋包装，置于600wa/m2光照箱内光照24小时后，置于干燥器中。

准确称取50.4mg样品，置于25ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

5　氧化

分别称取样品（50.2mg、50.1mg、50.4mg、50.4mg、49.9mg），分别置于25ml容量瓶中，各加入1.0ml水溶解，然后依次分别加入1ml浓度为1.2%H2O2、6%H2O2、9%H2O2、18%H2O2、30%H2O2溶液，放置1小时后，用水溶解并稀释至刻度。

6　酸降解

分别称取样品（50.5mg、49.8mg），分别置于25ml容量瓶中，各加入1.0ml水溶解，然后各加入1.0ml1N盐酸溶液溶解，分别放置3小时和24小时后，用1N氢氧化钠溶液中和，然后用水溶解并稀释至刻度。

7　碱降解

分别称取样品（50.4mg、50.2mg），分别置于25ml容量瓶中，各加入1.0ml水溶解，然后各加入1.0ml1N氢氧化钠溶液溶解，分别放置3hr和24hr后，用1N盐酸溶液中和，然后用水溶解并稀释至刻度。

8　高湿（80%）

称取约0.2g样品平摊于称量瓶，分别敞口放入干燥器中，干燥器底部放置饱和NaCL溶液，相对湿度为80%，密闭干燥器，置于2~8℃冰箱中，放置10天后取出样品。

将样品放至室温，准确称取50.3mg样品，置于25ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

（四）实验数据的计算与汇总对比

将上述降解条件下测得的结果汇总至下表。

表3各种降解条件下的主成分峰纯度结果

峰纯度：

≥995

名称

含量

主峰纯度因子

原样-1

100.6

999.9

原样-2

100.1

999.9

1.2%H2O2氧化

100.4

999.9

6%H2O2氧化

100.2

999.9

9%H2O2氧化

100.3

999.9

18%H2O2氧化

99.9

999.9

30%H2O2氧化

98.2

999.9

高温105℃

100.3

999.9

高湿80%

100.0

999.9

光照

99.4

999.9

避光

100.7

999.9

酸解3hr

100.6

999.9

碱解3hr

100.4

999.9

酸解24hr

99.7

999.9

碱解24hr

99.6

999.9

样品和各降解条件下的样品的纯度因子均大于995，说明该方法的专属性及稳定性指示性良好。

表4各种降解条件下已知杂质结果汇总

样品批号

胞嘧啶

α-异构体

总杂质

原样-1

0.0517

原样-2

0.0505

1.2%H2O2氧化

0.0029

0.0688

6%H2O2氧化

0.0165

0.0093

0.1759

9%H2O2氧化

0.0227

0.0161

0.2243

18%H2O2氧化

0.0584

0.0521

0.4818

30%H2O2氧化

0.0833

0.0864

0.6697

高温105℃

0.0608

高湿80%

0.0550

光照

0.5519

避光

0.0514

酸解3hr

0.0575

碱解3hr

0.0599

酸解24hr

0.0571

碱解24hr

0.0130

0.0964

“/”表示“未检出”

表5各种降解条件下未知杂质结果汇总

杂质RT

2.400—

2.505

3.794

3.978—3.995

4.233—4.258

4.403—4.433

4.590—4.613

4.818

5.923—5.949

8.668

10.185—10.253

21.608—22.292

23.562

杂质RRT

0.32

0.52

0.55

0.57

0.60

0.63

0.65

0.81

1.17

1.4

2.9

3.19

原样-1

0.0516

原样-2

0.0505

1.2%H2O2氧化

0.0054

0.0047

0.0521

6%H2O2氧化

0.0065

0.0200

0.0049

0.0226

0.0097

0.0101

0.0051

0.0511

9%H2O2氧化

0.0093

0.0242

0.0074

0.0331

0.0166

0.0055

0.0078

0.0536

18%H2O2氧化

0.0228

0.0048

0.0429

0.0126

0.0804

0.0582

0.0094

0.0178

0.0505

30%H2O2氧化

0.0334

0.0066

0.0431

0.0159

0.1150

0.0963

0.0017

0.0206

0.0523

高温105℃

0.0607

高湿80%

0.0549

光照

0.0098

0.3565

0.0167

0.0528

0.1299

避光

0.0514

酸解3hr

0.0575

碱解3hr

0.0600

酸解24hr

0.0571

碱解24hr

0.0130

0.0834

“/”表示“未检出”

三、实验的结果和方法可行性的分析

（一）含量及相关物质的系统适应性及专属性分析

1、含量方法系统适应性及专属性：

5份含量标准的RSD为0.09%<2.0%，在系统适应性溶液中，α-异构体与吉西他滨的分离度为14.9>8.0，吉西他滨的拖尾因子为1.1＜1.5，符合规定。

样品和各降解条件下的样品的纯度因子均大于995，该方法的专属性及稳定性指示性良好。

2、相关物质方法系统适应性及专属：

6针对照品的吉西他滨RSD为0.46%<2.0%，胞嘧啶RSD为1.88%<2.0%，在系统适应性溶液中，α-异构体与吉西他滨的分离度为11.9>8.0，吉西他滨的拖尾因子为1.0＜1.5，符合规定，相关物质方法系统适应性及专属性良好。

（二）各降解条件下的稳定性数据分析

1、在氧化条件下：

1　当H2O2浓度为1.2%时，主峰含量无明显变化（100.4%→100.4%）已知杂质胞嘧啶略有上升（ND→0.003%），a-异构体无变化（ND→ND），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.05%→0.05%），未知杂质RRT0.57略有所上升（ND→0.005%），总杂质略有所上升（0.05%→0.07%）；

2　当H2O2浓度为6%时，主峰含量无明显变化（100.4%→100.2%）已知杂质胞嘧啶略有上升（ND→0.02%），a-异构体略有上升（（ND→0.01%），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.05%→0.05%），未知杂质RRT0.57有所上升（ND→0.02%），总杂质明显上升（0.05%→0.18%）；

3　当H2O2浓度为9%时，主峰含量无明显变化（100.4%→100.3%）已知杂质胞嘧啶明显上升（ND→0.02%），a-异构体有所上升（（ND→0.02%），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.05%→0.05%），未知杂质RRT0.57明显上升（ND→0.03%），总杂质明显上升（0.05%→0.22%）；

4　当H2O2浓度为18%时，主峰含量无明显变化（100.4%→99.9%），已知杂质胞嘧啶明显上升（ND→0.06%），a-异构体明显上升（（ND→0.05%），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.05%→0.05%），未知杂质RRT0.57明显上升（ND→0.08%），总杂质明显上升（0.05%→0.48%）；

5　当H2O2浓度为30%时，主峰含量有所下降（100.4%→98.2%），已知杂质胞嘧啶明显上升（ND→0.08%），a-异构体明显上升（（ND→0.09%），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.05%→0.05%），未知杂质RRT0.57明显上升（ND→0.12%），总杂质明显上升（0.05%→0.67%）；

从上述氧化条件1.2%H2O2浓度至30%H2O2浓度的结果表明，盐酸吉西他滨在氧化条件下是不稳定的，随着氧化剂的浓度的增大，含量和各杂质降解明显，但是质量是守恒的。

2、在高温105℃条件下放置24hr，主峰的含量没有明显变化（100.4%→100.3%），已知杂质胞嘧啶无明显变化（ND→ND），a-异构体无明显变化（（ND→ND），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.06%→0.06%），总杂质无明显变化（0.06%→0.06%），说明盐酸吉西他滨在高温105℃24hr降解条件下相对稳定的。

3、在高湿（80%）条件下放置10天，主峰的含量没有明显变化（100.4%→100.0%），已知杂质胞嘧啶无变化（ND→ND），a-异构体无明显变化（（ND→ND），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.06%→0.05%），总杂质均无明显变化（0.06%→0.06%），说明盐酸吉西他滨在高湿（80%）降解条件下相对稳定的。

4、①在酸降解3hr条件下，主峰含量没有明显变化（100.4%→100.0%），已知杂质胞嘧啶无变化（ND→ND），a-异构体无变化（（ND→ND），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.06%→0.06%），总杂质均无明显变化（0.06%→0.06%），说明盐酸吉西他滨在酸降解条件下相对稳定。

②在酸降解24hr条件下，主峰含量略微下降（100.4%→99.7%），已知杂质胞嘧啶无变化（ND→ND），a-异构体无变化（（ND→ND），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.06%→0.06%），总杂质均无明显变化（0.06%→0.06%），说明盐酸吉西他滨在酸降解条件下相对稳定。

5、①在碱降解3hr条件下，主峰含量无变化（100.4%→100.4%），已知杂质胞嘧啶无变化（ND→ND），a-异构体无明显变化（（ND→ND），未知杂质RRT2.9无明显变化（0.06%→0.06%），总杂质无明显变化（0.06%→0.06%）。

②在碱降解24hr条件下，主峰含量略微下降（100.4%→99.6%），已知杂质胞嘧啶无变化（ND→

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