遗传学实验论文XXX大学污水处理厂进出口水质及重铬酸钾对蚕豆根尖微核的影响.docx

遗传学实验论文XXX大学污水处理厂进出口水质及重铬酸钾对蚕豆根尖微核的影响.docx

《遗传学实验论文XXX大学污水处理厂进出口水质及重铬酸钾对蚕豆根尖微核的影响.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《遗传学实验论文XXX大学污水处理厂进出口水质及重铬酸钾对蚕豆根尖微核的影响.docx（19页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

遗传学实验论文XXX大学污水处理厂进出口水质及重铬酸钾对蚕豆根尖微核的影响

XX大学污水处理厂进、出口水质及重铬酸钾对蚕豆根尖微核的影响

XXX大学

生命科学学院

生物技术

XXXXXXXXXX

指导老师：

XXXXXX

2010.11—2010.12

目录

1.引言3

1.1蚕豆根尖微核技术简介3

1.1.1蚕豆根尖微核技术的发展3

1.1.2蚕豆根尖微核技术的应用4

1.3微核识别的标准4

1.4实验数据的统计处理和污染程度的划分4

1.4.1各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN‰）的计算4

1.4.2污染指数（PI）判断4

1.5研究目的与意义5

2.材料与方法5

2.1实验材料5

2.1.1蚕豆种子5

2.1.2试剂5

2.1.3材料6

2.1.4水样采集6

2.1.5重铬酸钾试剂的处理6

2.2方法6

2.2.1蚕豆浸种催芽7

2.2.2被检测水样处理根尖7

2.2.3根尖细胞修复培养7

2.2.4固定根尖细胞7

2.2.5解离7

2.2.6染色7

2.2.7压片观察。

7

2.2.8数据统计及分析8

3结果与讨论8

3.1不同水样处理的蚕豆根尖微核千分率8

3.2各处理微核率方差分析10

3.3各处理微核率的多重比较10

4总结11

参考文献12

结语12

附：

统计软件SPSS17数据处理过程………………………………………………………13

实验光镜观察结果……………………………………………………………………15

[摘要]实验采用蚕豆根尖微核检测技术对武汉大学东湖分校污水处理厂进出口的水质及化学试剂重铬酸钾对蚕豆根尖微核的损伤作用进行了研究。

于处理厂进、出口进行水样采集，对重铬酸钾配制成三个浓度梯度，分别处理蚕豆根尖，检测各处理组水样对蚕豆根尖细胞形成微核的诱导效应。

结果表明，污水厂进、出口水质对蚕豆根尖细胞微核率均值差异极显著（P<0.01），说明污水处理厂对污水的净化有明显效果。

化学试剂重铬酸钾具有一定的毒性效应，可显著诱导蚕豆根尖细胞微核率的上升。

[关键词]蚕豆根尖微核污水重铬酸钾

1.引言

人们早在很久以前就已知道微核在细胞中存在，早期的血液学文献中，就曾经有过对微核的描述。

多年来，染色体异常的结果会产生微核已经成为一种共识。

而将微核作为快速监测环境中致突变因子的方法之一，则是近年来的发展。

微核测定是根据在细胞质内产生额外小核的现象来判断理化因素诱导染色体异常作用的一种简便的体内实验方法。

微核与染色体畸变有密切联系，可以说它是染色体畸变的另一种表现形式。

自上世纪七十年代初，Biiler和Schmid[1,2]建立这一方法以来，经过不断改进和发展，目前已在辐射损伤、药物、工业毒物、农业等独立工作中得到应用，尤其是建立了紫露草花粉母细胞四分体微核检测系统和蚕豆根尖细胞微核监测系统后，细胞微核技术在环境污染监测方面得到广泛的推广和应用。

蚕豆根尖细胞微核技术已被我国国家环境保护局审定编入了“生物监测技术规范”在全国推广应用，成为监测淡水污染的报警系统和监测系统。

1.1蚕豆根尖微核技术简介

1.1.1蚕豆根尖微核技术的发展

蚕豆（Viciafaba）根尖细胞的染色体大、DNA含量多、对诱变剂反应敏感,是一种很好的细胞遗传学研究材料。

早在1959年，放射生物科学家已经用蚕豆的根尖细胞来进行X射线的遗传损伤研究。

到了70年代，蚕豆根尖染色体畸变技术已发展得相当成熟，作为一种监测化学品遗传学毒性的方法为人们所知，并广泛采用。

而蚕豆根尖的微核实验是1982年由Degrassi和Rizzoni正式创立的[3]，他们指出微核实验与染色体畸变实验同样具有准确、快速、有明显的剂量——效应关系等特点，操作更简便，也更适于大批量样品的检测，并提出建立检测淡水污染诱变剂的警报系统。

在环境污染监测中得到了积极的推广和应用。

1.1.2蚕豆根尖微核技术的应用

蚕豆根尖微核试验的一个主要应用领域就是检测水体的致突变性。

在自然水体方面,陈光荣等引入污染指数的概念把微核率与污染程度联系起来[4]，根据测试水样微核率与自来水对照的比例,确定污染指数，再根据污染指数的大小进行水体污染分区。

在污染水体方面，该法可用于排污口废水的致突变性筛选和整个河段污染源的调查；另外，蚕豆根尖微核试验还可用于水源水、饮用水、医院污水、磁处理水等致突变性的检测。

值得一提的是,虽然蚕豆根尖微核试验并不是化学品安全测试的标准方法,但仍有不少报道证明蚕豆根尖微核试验对一些具体的化学污染物的致突变性也有敏感的指示作用[5~7]。

总之，蚕豆根尖微核技术在环境致突变性检测/监测方面已经形成了一套完整的体系。

随着科学的发展，其应用范围还将进一步扩大。

1.3微核识别的标准

在镜检细胞微核时，应按下列标准计数微核：

（1）凡主核大小1/3以下，与主核分离的小核；

（2）小核的着色与主核相当或稍浅；（3）小核形态可为圆形，不规则等。

1.4实验数据的统计处理和污染程度的划分

1.4.1各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN‰）的计算

对于蚕豆微核实验中微核千分率的计算可采用以下公式：

MCN‰=

×1000‰

1.4.2污染指数（PI）判断

如果采用市售蚕豆种子，按规范操作标准实验条件（其对照组为10‰以下），其监测样品污染程度的划分可采用“污染指数（PI）”判断：

、

根据《全国生物技术监测规范—蚕豆根尖微核技术》规定的污染指数划分标准，采用污染指数（PI）值来划分受污染程度。

此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN‰的波动，标准见表1-1[8]。

凡数值在上、下限时定为上一级污染。

表1-1污染指数PI值评价水质标准表

污染指数PI值水质污染等级

0～1.5基本无污染

1.5～2.0轻污染

2.0～3.5中污染

3.5以上重污染

1.5研究目的与意义

随着世界人口经济的增长，城市工业化的发展，工业三废不断排放，城市污水量在逐年增加，污水成分日趋复杂，污水中含有大量的病原体、致敏原、致癌原以及对人有急慢性毒作用的化学物质和放射性物质。

本研究中用蚕豆根尖细胞微核技术监测武汉大学东湖分校污水处理厂进出口水质污染情况，同时表明蚕豆根尖细胞对生活污水很敏感，蚕豆根尖微核技术可用于生活污水的监测。

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1蚕豆种子

青皮蚕豆（Viciafaba）购于武昌紫阳路某商贩

2.1.2试剂

Carnoys固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1,固定根尖,随用随配）盐酸酒精解离液、卡宝品红染液、重铬酸钾溶液（3个浓度梯度）、污水（污水厂进出、口水）、自来水。

2.1.3材料

显微镜（NikonYS100）、恒温培养箱（MJ-300Bs-Ⅱ上海新菌医疗器械制造有限公司）、镊子、载玻片及盖玻片。

2.1.4水样采集

武汉大学东湖分校污水处理厂是对武汉大学东湖分校整个污水环境处理中心。

本次水样采集地点是武汉大学东湖分校污水处理厂进口、出口采集水样，避光保存在4℃的环境中。

其具体情况见图2-1。

图2-1水样采集地点分布图

2.1.5重铬酸钾试剂的处理

将重铬酸钾原液10mg/mL按比例稀释成102倍、103倍、104倍终浓度为100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL三种规格试剂。

2.2方法

2.2.1蚕豆浸种催芽

选择发育正常、无损伤的蚕豆种子，洗净后用蒸馏水25℃浸种、催芽24～30h，此期至少换水2次；待种子充分吸胀后，移入铺有干净、双层湿纱布托盘内培养。

2.2.2被检测水样处理根尖

当初生根长到2～3cm时，选初生根生长良好的蚕豆3粒一组，分别放入3个浓度的重铬酸钾和两个污水中染毒12h，依次编号为1、2、3、4、5，另设第6组用自来水对照。

2.2.3根尖细胞修复培养

处理后的种子用自来水浸洗3次，每次2～3min；将处理液洗净后，置于湿棉花上恢复24h，温度均为25℃。

2.2.4固定根尖细胞

将恢复后的种子，从根尖顶端切下1～1.5cm长的幼根，用Carnoys固定液固定24h。

2.2.5解离

用蒸馏水浸洗固定好的幼根3次，每次5min，吸净蒸馏水，加入盐酸酒精解离液室温下酸解8-10min，幼根软化即可。

2.2.6染色

吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根3次，每次1～2分钟。

最后浸于水中。

制片前取出置载玻片上，截下1～2mm左右长的根尖，滴1-2滴卡宝品红染液染色10～15min后，加上盖玻片，覆以吸水纸常规压片。

2.2.7压片观察。

取出根尖分别置于载玻片上，切除根冠0.5mm后截取1mm左右根尖分生组织。

对各种不同处理的根尖分生组织进行常规压片，每个处理各取3个根尖压片。

在高倍镜下观察压片根尖分生区细胞分散良好的区域，镜检顺序如图2-2所示。

图2-2镜检顺序

2.2.8数据统计及分析

每个处理统计3条根尖，每个根尖观察1000个左右分散良好、质核清晰的细胞，测定微核千分率（MCN‰）和污染指数（PI）。

数据经SPSS17软件进行统计分析。

3结果与讨论

3.1不同水样处理的蚕豆根尖微核千分率

在对照组和各种水样处理组中均可见到一定数量的微核（图3）。

根据镜检统计结果，对5个处理组及空白对照组（自来水）样本的MCN‰进行统计（表3-1）。

结合《环境监测技术规范》对污染程度的划分标准，将实验各组中得出的污染成都分析见表3-2。

表3-1微核检测结果

组别

处理

根尖数

观察细胞数

视野中细胞中微核数/根尖

微核率‰

1

污水进口

3

1000，185，1144

33，6，35

31.85（32.54，32.4，30.6）

2

污水出口

3

681，1383，1097

8，19，11

11.80（11.7，13.7，10.0）

3

10-2倍原液

3

933，1203，1108

6，9，4

27.50（29.7，27.3，25.5）

4

10-3倍原液

3

1413，1098，157

42，30，4

5.83（6.4，7.5，3.6）

5

10-4倍原液

3

1589，267，912

2，0，1

0.78（1.25，0，0.78）

6

空白对照

3

1117，137，1243

1，1，0

0.57（0.9，0，0.8）

污水处理组重铬酸钾处理组空白对照组

图3显微镜下观察的微核实物图

根据表3-1的数据计算出各个取样点的污染指数（表3-2）。

表3-2实验处理各组的微核率与污染指数

采样地点

微核率（‰，

±s）

污染指数（PI）

污染程度

空白对照组

0.57±0.28

污水进口

31.85±0.62

55.30

重度污染

污水出口

11.80±1.07

20.73

重度污染

10-2倍原液

27.50±1.22

48.23

重度污染

10-3倍原液

5.83±1.16

10.23

重度污染

10-4倍原液

0.78±0.39

1.40

基本无污染

根据1986年颁布的《环境监测技术规范》[9]规定,对照组的微核率在10.00‰以下时,符合标准实验条件。

在表3-2中：

除10-4倍重铬酸钾原液的微核率与对照组微核率值低外，其他处理组的微核率均有明显的升高。

受试的水样可分为以下几个级别：

10-4倍重铬酸钾原液诱发的微核率其污染指数在1.50以下，属基本无污染；污水进口，污水出口，10-2倍重铬酸钾原液，10-3倍重铬酸钾原液所诱发的微核率其污染指数均大于3.5，属重度污染。

从两个污水取样点的水样所得实验数据上来分析可知，蚕豆根尖微核率和污水污染程度有关，且随着取样点的不同而存在差异性（表3-2）。

污水进口的PI值为55.30，污水出口的PI值为20.73，这说明了污水处理厂对污水的处理有一定的作用，但两者的污染指数均为重度污染。

结果表明，武汉大学东湖分校污水处理厂的进出口所排放的水质具有核损伤作用。

实验中设计的化学试剂重铬酸钾的三个梯度中，蚕豆根尖微核率和重铬酸钾浓度呈正相关。

重铬酸钾浓度越高，对蚕豆根尖微核损伤作用越明显。

3.2各处理微核率方差分析

用统计软件SPSS17对5个处理组和空白对照组的微核千分率进行F检验（表3-3），试验结果表明各处理水样的微核率差异极显著（F=240.660P<0.01）。

表3-3各处理微核率的F检验

变异来源

SS

DF

MS

F

P

组间

2766.194

5

553.239

240.660**

0.000

组内

27.586

12

2.299

总数

2793.780

17

**α=0.01

3.3各处理微核率的多重比较

用Duncan法检验对各水样的微核率实验数据进行多重比较，结果汇总于表3-4。

表3-4各水样点微核率的多重比较（Duncan法）

均值

-0.5667

-0.7833

-5.8333

-11.8000

-27.5000

污水进口

31.8467

31.2800**

31.0634**

25.4467**

20.0467**

4.3467**

10-2

27.5000

26.9333**

26.7167**

21.6667**

15.7000**

污水出口

11.8000

11.2333**

11.0167**

5.9667**

10-3

5.8333

5.2666**

5.0500**

10-4

0.7833

0.2166NS

空白对照

0.5667

**α=0.01

多重比较结果显示：

进口污水和出口污水的均值差异极显著；三组化学试剂处理（重铬酸钾）间均相互表现极显著；水样处理组与空白对照组中，除空白组与10-4倍原液不显著，与其他组均极显著。

进口污水和出口污水的均值差异极显著（P<0.01），说明污水处理厂对污水的净化是有明显效果的。

但其PI值均属于重度污染，结果说明污水处理不合格，仍不能直接排放。

化学试剂重铬酸钾10-2倍原液、10-3倍原液、10-4倍原液，三者均相互极显著，说明所设计药品浓度梯度明显，符合浓度越高，毒性效应越严重。

其差异性越显著（P<0.01）

空白对照组只与10-4倍原液无差异性（P>0.05）。

说明所选取10-4倍原液的重铬酸钾浓度已经很低，与空白组（自来水）很接近，对蚕豆根尖微核损伤作用不明显。

4总结

通过对XXX大学污水处理厂水体的检测表明，进口污水和出口污水的均值差异极显著（P<0.01），说明污水处理厂对污水的净化是有明显效果。

化学试剂重铬酸钾具有一定的毒性效应，可显著诱导蚕豆根尖细胞微核率的上升。

参考文献

[1]Boller，K.etal:

Humangenentik.1970,11：

35～54，1970.

[2]Schmid，Wetal:

Mutat.Res.1971，12：

1971，417～435，1971.

[3]陈光荣，金波，李明等.蚕豆根尖微核技术.见：

环境监测技术规范第四册生物（水环境部分）。

国家环保局，1986,75～78.

[5]金波、陈光荣，遗传独立与环境监测.1988，225.

[6]金波、欧光鉴等，蚕豆根尖微核试验敏感品种的筛选.华中师范学院学报（自然科学版），1984，

（2）：

101～108.

[7]陈光荣、金波、李明等.污染指数在微核技术监测水质污染中的应用.中国环境科学，1986，6

（2）：

60～63.

[8]希媛媛.蚕豆根尖细胞微核技术监测黄河兰州段水质污染的研究.甘肃联合大学学报，2005，19（3）：

51.

[9]中国环保局.《环境监测技术规范》第四册:

生物监测（水环境部分）[M].北京:

中国环境科学出版社,1986：

75－78.

结语

在本实验进行中，非常感谢XXX老师在实验阶段细心的指导，深入浅出的讲解了实验原理、实验过程、实验注意事项等。

同时也要感谢在一起做实验的同组同学在实验过程中的一起努力以及XXX大学生命科学学院实验室为此次研究提供实验室、实验材料等。

附：

统计软件SPSS17数据处理过程

描述

x

N

均值

标准差

标准误

均值的95%置信区间

极小值

极大值

下限

上限

进口

3

31.8467

1.08191

0.62464

29.1590

34.5343

30.60

32.54

出口

3

11.8000

1.85203

1.06927

7.1993

16.4007

10.00

13.70

10^-2

3

27.5000

2.10713

1.21655

22.2656

32.7344

25.50

29.70

10^-3

3

5.8333

2.01080

1.16094

0.8382

10.8284

3.60

7.50

10^-4

3

0.7833

0.68252

0.39405

-0.9121

2.4788

0.00

1.25

空白

3

0.5667

0.49329

0.28480

-.6587

1.7921

0.00

0.90

总数

18

13.0550

12.81952

3.02159

6.6800

19.4300

0.00

32.54

注：

实验中共做了六个水样处理：

进口污水、出口污水、10^-2倍原液、10^-3倍原液、10^-4倍原液和自来水（空白），每个处理做了三个平行试验，对每组三个数据分别进行均值、标准差、标准误、均值的95%置信区间的下限和上限、极小值及极大值等演算，判断组内各数据的有效性。

从表可知各数据均有效。

方差齐性检验

x

Levene统计量

df1

df2

显著性

1.328

5

12

0.317

注：

此步骤是为“单因素方差检验”做准备，将六组数据整体进行“方差齐性检验”，从表中“显著性0.317”大于0.05，得到结论各组方差是整齐的，可进行下一步“ANOVA检验”。

ANOVA

x

平方和

df

均方

F

显著性

组间

2766.194

5

553.239

240.660

0.000

组内

27.586

12

2.299

总数

2793.780

17

注：

此步骤为“单因素方差检验”，主要对各组均值的差异做比较，由表中“显著性0.000”小于0.01，可知各组均值差异极显著。

多重比较

同类子集

x

处理

N

alpha=0.05的子集

1

2

3

4

5

Duncana

空白

3

0.5667

10^-4

3

0.7833

10^-3

3

5.8333

出口

3

11.8000

10^-2

3

27.5000

进口

3

31.8467

显著性

0.864

1.000

1.000

1.000

1.000

将显示同类子集中的组均值。

a.将使用调和均值样本大小=3.000。

x

Duncana

处理

alpha=0.01的子集

1

2

3

4

5

Duncana

空白

.5667

10^-4

.7833

10^-3

5.8333

出口

11.8000

10^-2

27.5000

进口

31.8467

显著性

.864

1.000

1.000

1.000

1.000

将显示同类子集中的组均值。

a.将使用调和均值样本大小=3.000。

注：

由单因素方差检验判断各组均值差异极显著，但不知道是各组两两之间差异情况，由于做了“Duncan检验”，分别在a=0.05和a=0.01两个水平上进行了检验。

光镜观察结果

污水厂出口水处理图污水厂进口水

100μg/mL重铬酸钾溶液10μg/mL重铬酸钾溶液

1μg/mL重铬酸钾溶液空白对照（自来水）

注：

以上图片除空白对照在LM10x倍X40x倍其余均在LM10x倍X10x倍下观察结果