植物生理实验.docx
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植物生理实验
甘肃农业大学研究生课程考核登记表（考查课用）
考生姓名
学位名称（学科、专业）
发育生物学
考核方式
考查
是否学位课
否
成绩
学分
1
考查内容：
1.植物叶片细胞膜透性测定
2.植物材料MDA含量的测定
3.酸性茚三酮测定植物材料PRO的含量
4.离体快速称重法测定植物叶片蒸腾强度
5.气孔开闭状况的测定
教师评语
考查时间：
2012年6月3日主考教师签名：
附件
课程名称：
植物生理实验
共页
注：
1、本表用蓝黑或碳素墨水填写
2、学位名称（学科、专业）栏专业研究生填写学位名称，其它人员填写学科、专业名称。
3、成绩采用等级制，分优秀、良好、中等、及格和不及格5等。
4、学生的试卷、报告和其它相关材料列附件附在本表后。
5、考查结束后随《甘肃农业大学研究生成绩登记表》送到学院办公室，由研究生教学秘书负责
装入研究生业务档案。
\玄：
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植物生理实验技术实验报告
学院生命科学与技术学院
专业植物学
学号107331102304
指导教师
姓名
职称
完成日期
甘肃农业大学教务处制
实验一植物叶片细胞膜透性（REC测定
1.原理：
植物组织在受到各种不利的环境下（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时，细胞膜的结构和功能先受到伤害，细胞膜透性增大。
若将受伤害的组织浸入无离子水中，根据渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加，可反映出质膜受伤害的程度和所测材料抗逆性的大小。
2.材料：
丁香叶
3.仪器设备：
DDS-11型电导仪、真空泵、真空干燥器、以及其他实验室常用器皿和工具
4.试剂：
去离子水
5.方法步骤：
（1）清洗器具：
由于电导度变化非常灵敏，稍有杂质即产生很大的误差，因此所用玻璃均需先用热肥皂水清洗，然后用自来水、无离子水各洗四、五次（最好是容器口朝下用水冲），向洗净的试管中加入去离子水，用电导仪测定电导值，检查试管是否确实洗净。
（2）取样及处理：
选取丁香叶片清洗干净分成三份，一份放在室温下作为对照，一份放在50°C烘箱中，另一份放在冰箱的冷冻室内（温度大致-18°C）作为处理，大概半小时后将取出材料进一步用无离子水清洗干净，将叶片叠起来，用打孔器各打取12个圆叶片放入事先洗好的三支试管内，用去离子水冲洗一次，然后加入10毫升去离子水。
将试管放入真空干燥器内，开动真空泵抽气10min,已抽出细胞间隙空气。
缓慢放入空气，水即渗入细胞间隙，叶片变成透明状，细胞内溶质易于渗出。
取出试管，间隔几分钟振荡一次，在室温下保存30分钟。
（3）测定：
将DDS-11型电导仪电极插入试管，测定外渗液的电导值（LJ。
测定之后，将试管放入沸水能够10min以杀死组织。
冷却至室温后，再测定外渗液的电导值
（L2）。
（4）计算：
以细胞膜性对透性大小表示细胞的受害的程度，通常按下式计算：
细胞膜相对透性（%）=Li/L2X100
式中：
Li-叶片杀死前外渗液的导电值；L2-叶片杀死后外渗液的导电值。
直接计算细胞膜伤害率，通常采用下式计算：
伤害率（%）=[（T1/T2-Cl/C2）/（1-Cl/C2）]X100
式中：
Ci-对照叶片杀死前外渗液的电导值；C2-对照叶片杀死后外渗液的电导值;
Ti-处理叶片杀死前外渗液的电导值；T2-处理叶片杀死后外渗液的电导值；
6.计算结果
实验后测得数据如下：
叶片杀死前外渗液电导值
叶片杀死后外渗液电导值
常温
53.7
192.1
冻害
66.5
164.1
咼温
57.6
177.2
将测得数据代入式一得：
常温下细胞膜相对透性（％）=Li/L2X100=27.95%
冻害胁迫下细胞膜相对透性（％）=Li/L2X100=40.52%
高温胁迫下细胞膜相对透性（％）=L〃L2X100=38.15%
将测得数据代入式二得：
冻害胁迫下伤害率（％）=[（T1/T2-C1/C2）/（1-C1/C2）]X100=14.15%
高温胁迫下伤害率（%）=[（T1/T2-C1/C2）/（1-C1/C2）]X100=18.53%
[结果分析]:
比较不同处理（萎蔫处理与对照）的叶片细胞透性的变化情况，并加解释以及实验过程中应注意的事项。
答：
由实验数据可看出，不同处理下细胞透性均大于常温下细胞的透性。
这是因为烘箱烘烤和冰箱冷冻是植物细胞膜的通透性受到了高温和低温的迫害，因而细胞膜透性
较正常状态下大。
又因不同处理间由于受逆境的迫害时间和程度不同，因此膜透性也不
同。
试验中应注意以下事项：
1.CO2在水中的溶解度较高，测定电导时要防止高CO2气源和口中呼出的CO2进入试管，以免影响结果的准确性。
2.温度对溶液的电导影响很大，故应在相同温度下测定。
3.整个过程中，叶片接触的用具必须绝对洁净，也不要用手直接接触叶片，以免污
4.处理和对照的待测体积要一样。
5.每次测定前后电极要清洗干净。
实验二植物组织中丙二醛（MDA含量的测定
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可反映植物受逆境伤害的程度。
MDA从膜上产生的部位释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子物质的构型，或使之产生交联反应，从而丧失功能，还可使纤维分子间的桥键松弛，或者一直蛋白质的合成。
因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，因而MDA的含量反映着植物体内的相对氧化状态和植物对逆境条件反应的强弱。
1.原理：
MDA是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3，5，5，-三甲基恶唑-2，4-二酮），其最大吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm,但532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中DNDA-TBA反应物质含量是一定要排除可溶性糖的干扰。
所以在丙二醛含量测定时，同时测定450nm532nm和600nm下的吸光度,利用吸光度的差值计算丙二醛的含量。
2.仪器设备：
分光光度计、离心机、电子天平、10ml离心管、研钵、试管、刻度吸管
3.试剂：
10%三氯乙酸（TCA），0.6%硫代巴比妥酸（TBA）：
配比是先加少量的氢氧化钠
（1mol.「1）溶解，再用10%三氯乙酸定容。
4.材料：
丁香叶，常温（25C），低温（8C）、高温（50T）逆境胁迫
5.MDA的提取
称取剪碎的材料1g,加入2ml10%的TCA，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000r.mif离心10min,上清液为样品提取液。
6.吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml0.6%的TBA溶液，混匀物于水浴上反应15min,迅速冷却后再离心。
取上清液测定600、532、450nm波长下的消光值。
7.计算含量：
-1
Cmda（umdL）=6.45*（D532-D6oo）-O.56*D45o公式①
MDA含量（umolg-1）=Cmdax提取液体积（ml）/植物组织鲜重（g）公式②
测得三种不同处理下的植物叶片在532nm、450nm、和600nm下的消光值如下：
450
532
600
低温
1.236
0.879
0.371
高温
1.078
0.728
0.323
常温
0.963
0.673
0.320
由公式①可算出不同状态下MDA的浓度：
111
C常温=1.74（umolL）C低温=2.58（umolL）C高温=2.01（umdL）
根据上述公式②可得不同处理下MDA的含量：
MDA含量常温=1.74x10-2（umdg-1FW）MDA含量低温=2.58x10-2（umdg-1FW）
MDA含量高温=2.01X10-2（umdg-1FW）
［结果讨论］:
植物在逆境条件下或衰老期，吸水能力降低，体内水分亏缺；主动运输能力下降，透性增大，胞内物质外渗；气孔关闭，酶活性降低，光合作用下降；呼吸作用增强，消耗大量的营养物质；糖类和蛋白质大量水解；各细胞器也会由不可逆的损伤。
MDA作
为膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反应植物受逆境伤害或衰老的程度。
通过计算可以看出通过高温和低温处理的丁香叶片中丙二醛的含量均高于常温，说
明植物在受到逆境胁迫条件下丙二醛含量累积，植物叶片受到逆境迫害。
而低温和高温对植物叶片的迫害程度又不相同，本实验中低温的迫害较高温要大。
实验过程中由于大
家材料的处理时间不同，烘箱和冰箱在处理的过程中被打开导致材料处理的时间不是很严格，结果也与实验材料的处理程度和时间的差异而异。
在实验中应注意以下事项：
1.0.1-0.5%的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；
2.MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。
时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；
3.如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间。
4.可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm）,当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。
实验三酸性茚三酮测定植物材料Pro的含量
1.原理：
在正常环境条件下生长的植物,体内游离脯氨酸的含量较低。
但在逆境（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）条件下,植物体内游离脯氨酸的含量可增加10-100倍,因此有人提出游离脯氨酸的含量可作为植物抗逆性的指标。
植物体内的游离脯氨酸用磺基水杨酸或者酒精提取,在酸性条件下,脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色物质，用比色法与520nm波长下测定脯氨酸的含量。
2.仪器设备：
分光光度计,恒温水浴锅,研钵,试管,移液管,漏斗
3.试剂：
a.3%的磺基水杨酸b.冰乙酸c.甲苯
d.酸性茚三酮：
称取2.5g茚三酮，加入60mL冰乙酸和40mL6M磷酸，于70C下加热溶解，冷却后贮存于棕色瓶中备用。
4C下2-3日内有效。
4.实验材料：
丁香叶片，分高温（50C）处理30min,低温（-18C）处理30min和常温对照。
5.实验步骤：
分别取高温、低温处理和对照丁香叶片剪碎并各称取0.2g,放入试管中，加入5mL3%的磺基水杨酸，用封口膜封口，在沸水浴中提取15min,取提取液2mL，加入冰醋酸和酸性茚三酮各2mL，并摇匀，放入沸水浴中加热显色30min。
取出试管冷却至室温，向各管中加入5mL甲苯，充分摇动，以萃取红色产物，避光静置10-30min,使完全分层，用毛细管小心吸取萃取液，在520nm波长下测定消光值；在脯氨酸的标准曲线上查出脯氨酸的微克数。
6.结果计算：
脯氨酸（％）=［（CxV/A）/（Wx106）］x100
式中：
C=从标准曲线上查得脯氨酸微克数；
▼=提取液的总体积（ml）
A=测定时取用提取液ml数
W=样品重（g）,106=将克换算为微克
脯氨酸的标准曲线方程：
Y=7.2562X+0.3072（R2=0.9768）
式中X为吸光度值，Y为浓度（ug/ml）
三个不同处理在520nm波长下的消光值分别为：
常温D52o=O.1O9,低温D52o=O.238,
高温D520=0.226
带入标准曲线得出：
常温C=1.10,低温C=2.03，高温C=1.95
最后得出：
脯氨酸（％）=1.10爲吃弋.2XO-6X1OO=0.0014%（常温）
脯氨酸（%）=2.035H2£.2XO-6X100=0.0025%（低温）
脯氨酸（%）=1.955吃£.210-6X100=0.0024%（高温）
7.结果分析：
通过计算可知,经过高温和低温处理的丁香叶片脯氨酸的含量明显高于室温,说明脯氨酸有明显的积累现象,当植物受到渗透胁迫时,造成生理性缺水时脯氨酸会在植物体内大量积累。
在本实验中,材料在不同的逆境处理下测得的脯氨酸含量也不同,但低温处理的材料体内游离脯氨酸含量要稍高于高温处理下的材料。
思考.植物体内游离脯氨酸测定有何意义?
答：
在逆境条件下,当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。
植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水分情况及植物的抗逆性,抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。
因而测定脯氨酸含量可以作为植物抗旱育种的生理指标。
另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程,因而能降低冰点,有防止细胞脱水的作用。
在低温条件下,植物组织中脯氨酸增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。
实验四离体快速称重法测定植物叶片的蒸腾速率
蒸腾作用是水分从活的植物体表面（主要是叶子）以水蒸汽状态散失到大气中的过程,是与物理学的蒸发过程不同,蒸腾作用不仅受外界环境条件的影响,而且还受植物本身的调节和控制,因此它是一种复杂的生理过程。
蒸腾作用的生理意义：
它是植物吸收和运输水分的主要动力,可加速无机盐向地上部分运输的速度,可降低植物体的温度,使叶子在强光下进行光合作用而不致受害。
本试验以三叶草为材料,采用快速称重法,在1/100000电子天平下测定三叶草的蒸腾速率。
1、原理：
离体植物组织部位蒸腾失水,重量减轻,且在短时间内,其蒸腾速率与实际
情况接近。
因此，可用称重法测定得一定叶面积在一定时间内所失的水量来表示蒸腾速率。
2、仪器设备：
1/100000电子天平。
3、方法：
1•将选好的三叶草叶片置于电子天平上，立即记录重量及起始时间，待15分钟后
记录叶片的重量。
2.测定叶片面积采用方格纸法测定。
3.计算：
E=W/（A*t）
式中：
E—蒸腾速率（g.m-2.min-1）
W—蒸腾失水量（mg
A—叶面积（m2）
T—测定时间（min）
实验数据记录:
叶面积（m2）
起始重量（g）
最终重量（g）
时间（min）
蒸腾速率
-2-1
（g.m.min）
893X10-6
0.14363
0.14249
5
0.2553
893X10-6
0.14363
0.14065
10
0.3337
893X10-6
0.14363
0.13903
15
0.3434
893X10-6
0.14363
0.13793
20
0.3191
893X10-6
0.14363
0.13686
25
0.3032
893X10-6
0.14363
0.13579
30
0.2926
平均蒸腾速率
0.3079
思考：
为什么采用离体快速称重法测定植物叶片的蒸腾速率？
测定过程中应注意什么?
答：
蒸腾作用是植物水分代谢的重要过程。
蒸腾的快慢与矿质盐等在植物体内上运
的速度以及叶温等都有关系，特别是蒸腾速率还可以作为确定需水程度的重要指标，离
体快速称重法的特点在于能在自然条件下进行。
植物叶片虽然剪离母体，但短时间内生理上尚无明显变化，因此所求的蒸腾速率与实际情况近似。
但是随着失水量的增加，气孔开度变小，蒸腾速率将逐渐变小，因此实验应快速准确的完成。
保持植株的新鲜是测定蒸腾失水量的重要条件，另外在用方格法测定叶面积时应注意取舍。
实验五气孔开闭状况的测定
气孔是植物吸收CO放出Q、蒸腾HO的主要通道，对于保证光合作用的CQ供应、
维持植物体的水分平衡及利用最优化，意义重大。
狭义上常把保卫细胞之间形成的凸透镜状的小孔称为气孔。
有时也伴有与保卫细胞相邻的2—4个副卫细胞。
把这些
宽的细胞间隙（气室）。
气孔在碳气和水蒸汽的通路，其通过量是由要的意义。
气孔通常多存在于植物花瓣上也可见到，但多数沉水植物
细胞包括在内是广义的气孔。
紧接气孔下面有同化、呼吸、蒸腾作用等气体代谢中，成为空保卫细胞的开闭作用来调节，在生理上具有重体的地上部分，尤其是在叶表皮上，在幼茎、则没有，一般在叶下表皮较多
双子叶植物的气孔有四种类型：
①无规则型，保卫细胞周围无特殊形态分化
的副卫细胞；②不等型，保卫细胞周围有三个副卫细胞围绕；③平行型，在保卫
细胞的外侧面有几个副卫细胞与其长轴平行：
④横列型，一对副卫细胞共同与保卫细胞的长轴成直角.围成气孔间隙的保卫细胞形态上也有差异，大多数植物的保卫细胞呈肾形，近气孔间隙的壁厚，背气孔间隙的壁薄；稻、麦等植物的保卫细胞呈哑铃形，中间部分的壁厚，两头的壁薄。
影响气孔运动的主要因素：
1光照引起的气孔运动
保卫细胞的叶绿体在光照下进行光合作用，利用CO2使细胞内pH值增高，
淀粉磷酸化酶水解淀粉为磷酸葡萄糖，细胞内水势下降．保卫细胞吸水膨胀，气孔张开；黑暗里呼吸产生的CO2使保卫细胞的pH值下降，淀粉磷酸化酶又把葡萄糖合成为淀粉，细胞液浓度下降，水势升高，保卫细胞失水，气孔关闭。
保卫细胞的渗透系统也可由K来调节。
光合作用光反应（环式与非环式光合磷酸化）产生ATP,通过主动运输逆着离子浓度差吸收K，降低保卫细胞水势，吸水使气孔张开。
2二氧化碳影响气孔运动
低浓度CO2促进气孔张开，高浓度CO2使气孔迅速关闭，无论光照或黑暗皆如此。
抑制机理可能是保卫细胞pH下降，水势上升，保卫细胞失水，必须在光照一段时间待CO2逐渐被消耗后，气孔才迅速张开。
3温度影响气孔运动
气孔张开度一般随温度的上升而增大，在30％左右达到最大，低温（如10％以下）虽长时间光照，气孔仍不能很好张开，主要是淀粉磷酸化酶活性不高之故，温
度过高会导致蒸腾作用过强，保卫细胞失水而气孔关闭。
4叶片含水量影响气孔运动
白天若蒸腾过于强烈，保卫细胞失水气孔关闭，阴雨天叶子吸水饱和，表皮细胞含水量高，挤压保卫细胞，故白天气孔也关闭。
5.风
微风时对气孔的打开有促进作用，因为微风可以适当降低叶片周围的温度。
大风则促使气孔关闭。
6.化学物质
醋酸苯汞、阿特拉津、乙酰水杨酸等能抑制气孔开放，降低蒸腾。
脱落酸的低浓度溶液洒在叶表面，可抑制气孔开放达数天，并且作用快，在2〜10分钟内
可使多种植物气孔开始关闭。
细胞分裂素可促进气孔开放。
本试验以三叶草为材料，采用印迹法在显微镜下观测气孔密度和开度。
一、原理把有机溶胶涂在植物的表面，胶体风干后就凝成薄膜，这膜就印有表皮组织各细胞的边界痕迹，从而显示出气孔的开闭情况，此法除用来观测气孔外，还可用于观测表皮组织上的细胞，茸毛以及蜜腺、蜜盘、刺、鳞片等。
二、材料、仪器设备及试剂
1.材料：
三叶草叶片。
2.仪器设备：
显微镜；目镜测微尺；载玻片；盖玻片；棉签，尖头镊子。
3.试剂：
蒸馏水，火棉胶。
三、实验步骤
（一）气孔密度测定
1、用棉签将火棉胶涂在三叶草的下表皮。
2、数分钟后，撕下火棉胶膜，在材料不同部位观察不少于5个视野，求出平均视野气孔数a。
3.将目镜测微放入目镜中，测出目镜刻度大小。
如果物镜测微尺X个刻度相当于目镜测微尺的丫刻度，则目镜测微尺的丫个刻度实际长度应为10Xum
4.将目镜测微尺沿视野的直径安放。
设视野直径长度等于目镜测微尺的Z个刻度,
则直径应为：
10X/Yum,视野圆面积应为：
S=3.1416*（10XZ/2Y）务吊=7.854*10-5*XZ/Y）2mrm
5.气孔密度（气孔数/mm2）应为a/S
（二）气孔开度测定
显微镜目测微尺直接测量气孔大小
根据显微镜测微尺的使用，在显微镜下观测火棉胶显示的气孔大小。
四、实验结果
1.气孔密度
表中为目镜下每个视野观测到的气孔数目:
视野序号
气孔个数
视野序号
气孔个数
视野序号
气孔个数
1
6
18
8
35
7
2
3
19
7
36
6
3
4
20
4
37
3
4
5
21
6
38
7
5
8
22
4
39
8
6
3
23
7
40
5
7
6
24
6
41
4
8
4
25
7
42
6
9
6
26
7
43
8
10
5
27
3
44
7
11
7
28
7
45
6
12
5
29
8
46
8
13
6
30
6
47
7
14
7
31
7
48
6
15
8
32
6
49
4
16
4
33
7
50
3
17
6
34
5
视野内平均气孔数目为：
5.86个
22
视野面积=3.1416*（0.01*58/13）=0.00604mm
由此气孔密度=8.7/0.00583=970.55个/mm2
2.①气孔大小测定（mr）
序号
长
宽
序号
长
宽
序号
长
宽
1
0.0062
0.0031
18
0.0085
0.0038
35
0.0077
0.0031
2
0.0062
0.0038
19
0.0085
0.0038
36
0.0069
0.0031
3
0.0069
0.0038
20
0.0077
0.0031
37
0.0077
0.0031
4
0.0062
0.0031
21
0.0069
0.0031
38
0.0077
0.0038
5
0.0069
0.0038
22
0.0062
0.0027
39
0.0077
0.0035
6
0.0085
0.0038
23
0.0069
0.0031
40
0.0085
0.0038
7
0.0077
0.0035
24
0.0069
0.0031
41
0.0069
0.0031
8
0.0069
0.0031
25
0.0077
0.0035
42
0.0062
0.0023
9
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