基因作业整理1.docx

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基因作业整理1

Chapter19HomologousandSite-SpecificRecombination

1.PleaseexplainwhymostofengineeringE.colicellstrainforproteinover-expressionhasthegenetictypeofRecA-?

（3points）

答：

大肠杆菌中的RecA蛋白是第一个被发现的DNA链转移蛋白，这类蛋白质在重组中起着核心作用。

如果某质粒可能携带可作为大肠杆菌重组系统的底物的DNA重复序列，那就应该考虑换用重组缺陷型菌株的可能性。

用携带有recA基因突变的菌株就几乎没有重组的可能性。

2.PleasereadInvitrogencatalog,andexplainhowasingleGatewayentryplasmidcanbeappliedformultipledifferentapplications.Detaildescriptionisexpected.（7points）

答：

Gateway这种克隆方法可以使DNA片段通过位点特异的重组在载体之间转移。

它是利用λ嗜菌体位点特异重组系统（attBxattP→attLxattR）。

λ嗜菌体上的DNA要进入细菌染色体，要在细菌和噬菌体DNA上的特定位点通过重组产生整合和外切作用，这些位点叫做att位点。

细菌上的att位点称为attB，噬菌体上的附着位点称为attP，attB和attP都有序列核心序列O，重组就发生在这个序列内。

环状的噬菌体DNA必须以线性的形式插入到细菌染色体中，而前噬菌体则结合到两个新的att位点，它们的重组产物分别被称为attL和attR。

融合要求attP和attB之间的识别，而外切要求attL和attR之间的识别。

Gateway就是基于这种λ嗜菌体位点特异重组系统（attBxattP→attLxattR）。

BP和LR两个反应就构成了Gateway技术。

BP反应利用一个attBDNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个entry克隆。

LR反应是一个attLentry克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。

LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。

完成构建Gateway™表达克隆仅需两步：

1创建entry克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进entry载体。

2混合包含目的基因的entry克隆和合适的目的载体及GatewayLRClonase酶，产生表达克隆。

（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。

）

用Gateway技术利用了位点特异重组，进行克隆可以去除用多种限制性内切酶克隆的繁琐步骤，可以方便地将目的片段转入多个表达系统（细菌、酵母、昆虫或哺乳动物）。

并且克隆效率达95%以上。

当基因快速简便地进入目的表达载体时，还能保证正确的方向和阅读框。

Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。

3.Pleasereadtextbookcarefully,brieflydesignamethodtodistinguish“sequentialexchange”or“concertedcutting”duringrecombinationbetweenattPandattB.（5points）

答：

“自杀底物”可以使重组反应停留在中间体的阶段，此时核心序列被切开，而这个切口干扰了重组过程，这样就可以识别出已经起始重组，但还未完成的分子，这些中间体的结构表明单链交换是按前后顺序发生的。

4.PleasereadtextbookcarefullyanddescribedifferencesbetweentypeItopoisomeraseandtypeIItopoisomerase.

答：

DNA拓扑异构酶是可以催化DNA拓扑结构变化的酶。

它们暂时解开DNA的一条或两条链，使没有断裂的链穿过缺口，然后重新封住缺口。

型拓扑异构酶在DNA中的一条链上产生一个暂时的缺口，

型拓扑异构酶引入一个暂时的双链断裂。

Chapter20DNARepairSystem

1.PleaselistRecA’sfunctioninbothDNArecombinationandDNArepair（5points）

答：

在DNA重组中：

RecA具有的处理DNA活性使一条单链能与一条双链体中的同源部分发生置换，这个反应称为单链同化。

这个置换反应可以发生在几种不同构型的分子之间，并需要三个一般性条件：

其中一个DNA分子必须有单链区域；有一个分子必须有游离的3’端；单链区域和3’端必须位于这两个分子的互补区域中。

单链同化需要一个中间体以使两条单链从一条双链体交叉到另一条，RecA可以催化这个阶段的反应。

在细菌中，RecA作用于RecBCD所产生的底物，而RecBCD介导的解链和切割可以产生起始异源双链体连接点形成的末端，RecBCD在chi位点切开释放出3’端，RecA可以携带含此3’端的单链并使它与同源的双链体序列作用，于是就产生了联合分子。

在DNA修复中：

RecA蛋白直接参与重组修复，它还有另一个功能：

可以被许多导致DNA损伤或抑制大肠杆菌复制过程的处理激活，这些处理使它引发一系列复杂的表型变化，称为SOS应答。

起始应答的事件是RecA被损伤处理所激活，RecA的激活引起LexA基因产物的蛋白酶解切割，这种LexA发生自我切割后导致其自身的阻遏操纵子的活性失活。

LexA蛋白能抑制许多基因的表达，包括起修复作用的recA和lexA。

RecA的激活引起LexA蛋白的水解，从而诱导所有这些基因表达。

在重组修复系统中，首先RecBC参与在一条子代双链体中产生单链末端，然后被RecA用来与另一条子代双链体配对。

2.Pleasebrieflydescribedifferencesbetweenexcisionrepairandrecombinationrepair（5points）

答：

外切修复系统是把DNA链从损伤位点移去，然后替换它；而重组修复系统是利用重组来替换损伤的双链体区域。

理论上，外切修复途径可以发生在任何时间，但是重组修复在一条带有损伤序列拷贝的双链体存在时才能发挥作用，也就是说，它发生在复制以后。

具体差别如下：

识别酶能辨别出实际的损伤碱基或DNA空间路径上的改变，由此由识别酶所启动的外切修复系统（excisionrepair）通常能校正错配。

这个系统有两种类型：

主要的外切修复途径类型：

而重组修复系统的一个主要作用是重新启动停滞的复制叉。

当复制叉遇到损伤，会停止前移，停滞复制叉结构与两条DNA双链体重组产生的Holliday连接点相同，所以成为解离酶的靶标。

如果解离酶切割互补链中的任何一对，双链断裂就能产生。

这可以用重组系统来修复。

3.Pleasethinkabouttheadvantage/disadvantageofthemutationbasedexplorationofbiologicalprocessandmolecularmechanismofsomebiologicalprocesses.Isthereanyalternativeroutetoexplorebiologicalquestions?

Ifyes（sure,thereis）,pleasebrieflydescribeyourcommentsandsuggestions.（10points）

答：

优点：

碱基突变包括碱基的添加、删除、点突变等。

碱基突变是研究生物学过程和其中一些分子学机制的有力工具。

对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质结构或结构域。

对于某些对生物体有影响的碱基，通过这种突变的方法，可以了解基因在生物体中的作用。

缺点：

对于一些在生物体中作用不明显的基因，不能通过这种方法对基因的功能有所了解。

另外，有一些基因是突变致死的，也不能通过突变的方法来研究其功能。

另外一些研究的方法：

1.可以通过查与其同源的基因在其它生物尤其是亲缘关系很近的生物体内是否有已知功能，来推测想了解的基因的功能。

2.寻找该基因过量表达的个体，观察表型和一般个体的差异，也可以作为研究其功能的参考。

3.通过RNAi沉默这个基因，干扰基因的表达，来研究基因的功能。

Chapter21,22Transposon&RetrovirusesandRetroposons

1.Bothplasmidsandtransposonscantransfergenefromonelocationtoanotherlocation.Whataredifferencesbetweenplasmidsandtransposons?

（3points）

答：

质粒是通过接合作用来转移信息。

转座子是基因组中移动的一段不连续序列，可将其本身在基因组内从一个位置转移到另一个位置。

转座子的特征是它们并不利用独立形式的元件（如质粒DNA或噬菌体或质粒DNA），而是从基因组的一个位置直接移动到另一个位置。

转座子不依赖于供体和受体位点序列间的任何联系。

转座子限定于将其自身（有时连带一些其他序列）转座到同一基因组内的新位置，因此，相对于能将序列从一个基因组转移到另一个基因组的载体而言，转座子只是基因组内的载体类似物，是基因组内突变的主要来源。

2.WhatarethreedifferenteffectsoftransposonsbringtotargetDNA?

Explain“SelfishDNA”.（4points）

答：

1在反应中，转座子被复制。

转座子中被移动的部分被拷贝，一个拷贝保留在原位点，而另一个则插入新的位点，因此转座伴随着转座子拷贝数的增加。

这种是复制型转座。

2转座子仅从供体位点向受体位点做物理性移动，从而在供体位点造成断裂，如果断裂不被修复，后果将是致死的。

这种是非复制型转位。

3只有序列的直接移动，没有核苷酸的损失。

这种是保守型转位。

自私DNA：

与生物体的基因型无关的序列，唯一的目的是使自己永生化于基因组内。

3.WhataredifferencesbetweenDNAandRNAmediatedtransposon?

（5points）

答：

转座子分为两个基本类型：

一种是以编码蛋白质的DNA序列的形式存在，其编码的蛋白能直接操作DNA，从而使转座子能够在基因组内繁殖其自身。

这是DNA介导的转座。

另一种与反转录病毒有关，并且它们可移动的特性来自于它们能由RNA转录物产生DNA拷贝，这种DNA拷贝然后被整合到基因组的新位点。

这是RNA介导的转座。

（1）RNA介导的转座比DNA介导的转座多一步逆转录过程。

RNA介导的转座子要先逆转录为双链cDNA，才插入转座位点。

（2）由RNA介导的转座仅发生在真核生物和病毒中。

（3）反转座子共有的可鉴定的特性为：

插入位点会产生短的靶序列的正向重复。

4.Brieflydescribemechanismsofreplicativeandnonreplicativetransposition.（8points）

答：

复制型转座：

链转移复合体的3’端作为复制的引物，产生一个称为共合体的结构，它由两个起始分子融合而成。

共合体有转座子的两份拷贝：

一份拷贝位于原来复制子之间的每个连接处，取向为正向重复序列。

Chapter23ImmuneDiversity

1.Pleasedrawadiagramofconcensussequenceanddescribewhatareconsensussequences’roleinImmuneRecombination.（5points）

答：

轻链和重链基因组装的机制是相同的，所有参与连接反应的生殖细胞基因片段的边界处都有共有序列。

每个共有序列包括一个七聚体和一个九聚体，它们被12bp或23bp的序列所分隔。

作用：

带有一种间隔的共有序列仅能与带有另一种间隔的共有序列连接。

V片段和J片段的共有序列可以以任何方向进行排列，间隔的不同也不能提供任何方向性的信息，不过都能够阻止一条V基因片段和另一条V基因片段重组以及一条J基因片段和另一条J基因片段重组。

2.Pleasehowrandomnucleotidesweregeneratedduringgenesegmentjoininganddescribetherandomnucleotides’roleinImmunoglublindiversity.（5points）

答：

在RAG蛋白催化断裂和重连的过程中，RAG1能识别七聚体或九聚体上特有的12/23间隔的信号，然后吸引RAG2形成复体物。

九聚体提供起始识别的位点，七聚体则提供切割位点。

RAG1，2首先在每个连接区产生切口，之后在编码端和信号端的末端游离羟基攻击另一条链的键，形成发夹结构，然后靠近发夹结构的一条链被切割。

切割链因为不能配对而产生自由端。

这时有一些额外碱基（随机序列）被插入到编码末端，称为N核苷酸。

它们的插入由脱氧核苷酸转移酶催化，并发生在连接过程中所形成的游离3’端。

然后单链末端被填充，编码端连接。

作用：

确保了编码区的连接能产生一条与V、D和J区域的编码末端直接连接产生的序列不同的序列。

在连接处，序列的改变能使该位点编码的氨基酸产生多样性。

连接处的编码区碱基对数目的改变能影响读框。

3.Whatissomaticmutationandexplaintheirrolesinsecondaryresponse.（5points）

答：

Somaticmutationoccurassubstitutionofindividualbases.SiteofsomaticmutationareconcentratedintheAntigen-bindingsite.

重排产生一条有功能的Ig基因后，有两种机制可以引起V区基因的变化。

其中一种机制是在小鼠及人类中，活性淋巴细胞基因上的个别位点发生体细胞突变。

这个过程有时称为超突变。

作用：

次级免疫应答是通过B细胞的记忆功能来实现的。

体细胞突变产生了与抗原有更高亲和力的B细胞，尽管这些细胞也经历了同类型转换来选择其他的CH区，它们暂时不引发应答。

它们以记忆细胞的形式存储起来。

如果与同一种抗原再次接触，则它们被激活。

由于这些细胞是对应这种抗原预先选择出来的，所以它们能够很快通过克隆扩增产生次级免疫应答。

4.Brieflydescribedifferencesbetweenhumoralimmunityandcell-mediatedimmunity.（5points）

答：

体液免疫应答是由B细胞执行的。

此应答是由B细胞分泌的抗体，也就是免疫球蛋白介导的。

针对外来分子产生特异性抗体是识别外来抗原的最基本环节。

这种识别要求抗体能够结合到抗原的一小部分结构或区域上。

体液免疫在两方面依靠其他的免疫反应组分。

首先，B细胞需要T细胞提供信号而分泌抗体；其次，抗原-抗体复合物的形成触发抗原被消灭，它最主要的路径是由补体来完成的。

细胞免疫应答是由一类称为细胞毒性T细胞，也称为杀伤性T细胞的T淋巴细胞所执行的。

T细胞的基本功能是识别抗原。

细胞免疫通常是由细胞内的寄生物所诱发的，如病毒的感染。

病毒感染后，外来抗原被呈现于细胞表面，被T细胞受体识别，此受体是由T细胞产生的，相当于B细胞产生的抗体。

这种识别最重要的特征是抗原必须被一种称为主要组织相容性复合物（MHC）的蛋白质所呈递。

T淋巴细胞要求能同时识别外来抗原和MHC蛋白，确保了细胞免疫应答仅能发生在被外来抗原感染的宿主细胞内。

Chapter24PromotersandEnhances

RegulationofTranscription（Access/Initiate/Increase）

1.PleasebrieflylistdifferentfunctionsofTFIIA,TFIIB,TFIID,TFIIE,TFIIFandTFIIH.AseriesofdiagramdescribingprocessofRNAtranscriptioninitiation,RNAelongation,maturationwillbeencouraged（5pts）

答：

当TFIIA加入复合体时，TFIID就能够保护更上游的一段DNA区域，TFIIA可能是通过消除TAFII230的阻遏作用来活化TBP的。

TFIIB的加入能部分保护起始点邻近区域内的从-10位到+10位模板链的区域。

TFIID=TBP+TAFsbindatTATA，TFIID结合到TATA盒上是转录起始的第一步。

TFIIE的结合使被保护的DNA区域边界又向下延伸了一圏双螺旋，达到+30位，它通过水解ATP融解DNA而使RNA聚合酶开始移动。

TFIIH

2.PleaselistallpossiblerolesofCTDofRNAPolymeraseIIduringRNAtranscription.（5pts）

答：

CTD（羧基端结构域）

RNA聚合酶II的最大亚基中含有一个CTD，这个结构域是由含7个氨基酸残基的重复序列组成，是RNA聚合酶II所独有的。

CTD尾部需要被磷酸化，以使RNA聚合酶II能从各种转录因子的包围中释放出来，从而过渡到转录的延伸形式，在这个阶段，大多数转录因子从启动子上解离下来。

有一些基因的RNA聚合酶II在前进了一小段距离后会终止转录，这时需要一种叫做P-TEFb的激酶使CTD进一步磷酸化，才能继续转录延伸。

这些都指出CTD可能是转录中连接各种加工反应的通用关键点，如在加帽和剪接的例子中，CTD直接促进了承担反应的各种蛋白质复合体的形成。

在产生3’端这个例子中，CTD可能直接地参加了这个反应。

3.Pleasebrieflydescribehowenhancersincreaseefficiencyoftranscriptioninitiation?

Pleasealsodesignasimpleexperimenttoprovetheenhancer’sinfluencingmode（5pts）

答：

增强子的根本作用是增加启动子附近激活剂的浓度。

当增强子和启动子分别处于DNA片段的两端时，它不能有效地进行转录，但是当它们之间以蛋白质桥相连接时，增强子就可以刺激转录，所以关键的特征是让增强子和启动子相互靠近。

设计实验：

1使增强子和启动子分别位于分开的并且没有相互作用的两个DNA环上时，检测其是否有转录发生；

2使增强子和启动子分别位于一段不能弯曲线性DNA的两端，检测是否有转录发生；

3突变增强子区域，使其失去提高启动子附近激活剂浓度的作用，检测转录是否发生。

根据这种增强子作用模型，以上实验应该都不能检测到转录的发生。

Chapter25activatingtranscription

1.PleaselistdifferentwaysofregulatoryfactorswerecontrolledtoactivateRNAtranscription.Briefdiagramsarerequired（10pts）

答：

基本转录因子（basalfactor）和RNA聚合酶一起结合于起始点和TATA盒。

激活剂（activator）是特异性识别短共有序列元件的转录因子。

它们结合于启动子或增强子的位点上。

它们通过增加基本转录复合体（basalapparatus）结合于启动子的效率而起作用，因些啬了转录频率，它们是启动子充分起作用所必需的。

一些激活剂的作用是连续的（它们是普遍的）；而另一些的作用则是有规律的，它们在特定组织和特定时间合成或激活，因些，后者在时间和空间上调控着转录模式，它们所结合的序列被称为应答元件（responseelement）.

与转录效率有关的另一组因子自身并不与DNA结合。

辅激活剂（coactivator）连接了激活剂和基本转录复合体。

它们通过蛋白质-蛋白质相互作用来起反应，在激活剂和基本转录复合体间形成桥梁。

一些调节因子可使染色质结构改变。

2.Pleaselist4differentpossibleDNAbindingdomains.Whataretwoverycommonandbasicpropertiesofallofthe4differentDNAbindingdomains.（10pts）

答：

1锌指基序：

其中一小段保守氨基酸与Zn2+结合，形成一个相对独立的区域。

有两类DNA结合蛋白含有这种结构：

经典的“锌指”蛋白质和类固醇受体。

典型“锌指蛋白”含有一连串锌指，单个锌指的共有序列为：

此结构基序是根据其伸出锌结合位眯的氨基酸环命名的，称为Cys2/His2锌指。

Zn2+位于保守的Cys和His残基所组成的四面体内。

锌指本身包含约23个氨基酸，锌指间由7-8个氨基酸残基相连。

2类固醇受体

3Homeodomain（HTH）

4Helix-Loop-Helix（HLH）andLeucineZipper

共同点：

1都有a-helix

2都可以电荷间相互作用与DNA大沟相互作用

Chapter26RNASpicingandProcessing

1.Pleasebrieflydescribe/explaintheexperimentswhichwasconductedtotellthat“splicingreactionforamulti-intronRNAdoesnotproceedsequentiallyalongtheprecursor”and“notinascanningmode”.（10pts）

答：

可以用RNA印迹法来鉴定出能代表某些内含子被去除的中间体的那些细胞核RNA。

结果出现的一系列不连续的带说明剪接有特定的途径，因为如果实验RNA的7条内含子的去除是随机的，则理论上应有300种以上的不同组合的中间体出现，而结果没有出现。

这些剪切中间体说明内含子的去除似乎没有特定顺序，但存在一条或几条优先途径。

以上分析得出结论：

RNA的构象影响剪接位点的供给。

在去除特定内含子后，构象发生改变，又提供了新配对的剪接位点。

但前体在去除内含子时有不止一种顺序的能力提示，每一个剪接阶段都可以有不同的构象。

当然分子越长可供选择的结构越多，基因越大越难分析二级结构对剪接的控制。

于是可以得出结论：

剪接反应并不是按照内含子在RNA前体上的顺序进行的