第五章 微生物发酵制药.docx

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第五章微生物发酵制药

第五章微生物发酵制药

教学目的：

了解微生物药物种类；

掌握微生物生物合成调节机制、发酵工艺条件的确定；

教学重点

微生物制药工艺条件的确定

计划学时：

4

第一节概述

一微生物发酵制药的研究范围

引言：

微生物发酵制药的发展简史概述：

1929年Fleming偶然发现了青霉素，10年后，青霉素开始用于医学方面。

1939年~1976年，Waksman和他所领导的Waksman微生物研究所报道的抗生素近30种，包括链丝菌素、棒曲霉素、蜡黄酸、链霉素、小单孢菌素、灰霉素、新霉素、弗氏菌素、抗霉菌素、杀假丝菌素和紫红菌素等。

我国起步较晚，

1953年5月1日上海第三制药厂青霉素；

1958年华北制药厂（生产抗生素），投产了青霉素、链霉素、土霉素和红霉素等品种

随后全国陆续建立起一批微生物发酵药厂。

1957年氨基酸发酵的研究

1964年谷氨酸的发酵成功，并投入生产。

50年代还开始了核酸类物质的发酵研究

在60年代后期开始了酶制剂研究与生产

维生素生产方面，于70年代成功地研究出“二步发酵法”生产维生素C的技术，在国际上处于先进水平。

微生物发酵的药物必须借助发酵工程来完成，深层通气培养法的建立，为微生物发酵制药提供了新的概念和模式；细胞融合技术和基因工程为微生物制药来源菌的获得提供了一种有效的手段。

（一）研究内容

微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。

研究内容包括微生物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯化工艺等。

主要讨论用于各类药物发酵的微生物来源和改造、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工艺与主要参数的确定、药物发酵过程的优化控制、质量控制等。

（二）研究范围

微生物菌体发酵：

即以获得具有药用菌体为目的发酵。

如：

帮助消化的酵母菌片和具有整肠作用的乳酸菌制剂等；药用真菌，如香菇类、灵芝、金针菇、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌以及与天麻共生的密环菌等药用真菌；一些具有致病能力的微生物菌体，经发酵培养，再减毒或灭活后，可以制成用于自动免疫的生物制品。

微生物酶发酵：

目前许多医药用酶制剂是通过微生物发酵制得的，如用于抗癌的天冬酰胺酶和用于治疗血栓的纳豆激酶和链激酶等。

微生物代谢产物发酵：

微生物在其生产和代谢的过程中，产生的各种初级代谢产物和次级代谢产物中许多是可以用于制作药物的。

如初级代谢产物：

氨基酸、蛋白质、核苷酸、类脂、糖类以及维生素等；

次级代谢产物：

抗生素、生物碱、细菌素等。

微生物转化发酵：

微生物的转化就是利用微生物细胞中的一种酶或多种酶将一种化合物转变成结构相关的另一种产物的生化反应。

包括脱氢反应、氧化反应（羟基化反应）、脱水反应、缩合反应、脱羧反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等，这些转化反应特异性强，反应条件温和，对环境无污染，微生物转化制药最突出的例子则是甾族化合物的转化和抗生素的生物转化等。

近年来，随着生物工程的发展，尤其是基因工程和细胞工程技术的发展，使得发酵制药所用的微生物菌种不仅仅局限在天然微生物的范围内，已建立起了新型的工程菌株，以生产天然菌株所不能产生或产量很低的生理活性物质，拓宽了微生物制药的研究范围。

二微生物发酵药物的分类

微生物药物可以按生理功能和临床用途来分类，还可以产品类型来分类，但通常按其化学本质和化学特征进行分类。

（1）抗生素类

抗生素是在低微浓度下能抑制或影响活的机体生命过程的次级代谢产物及其衍生物。

目前已发现的抗生素有抗细菌、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗原虫、抗藻类、抗寄生虫、杀虫、除草和抗细胞毒性等的抗生素。

据不完全统计，已知的抗生素总数不少于9000种，其主要来源是微生物，特别是土壤微生物，占全部已知抗生素的70%左右．至于有价值的抗生素，几乎全是由微生物产生。

（2）氨基酸类药物

个别氨基酸制剂：

主要用于治疗某些针对性的疾病，如用精氨酸和鸟氨酸治疗肝昏迷，解除氨毒；胱氨酸用于抗过敏、肝炎及白细胞减少症等；

复方氨基酸制剂：

主要为重症患者提供合成蛋白质的原料，以补充消化道摄取的不足。

利用微生物生产的氨基酸分微生物细胞发酵法和酶转化法，其中发酵法生产的氨基酸有谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸等。

采用酶转化法生产的氨基酸有天冬氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸等。

（3）核苷酸类药利用微生物发酵工艺生产的该类药物有肌苷酸、肌苷、5′-腺苷酸（AMP）、腺三磷（ATP）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、辅酶A（CoA）、辅酶I（CoI）等。

（4）维生素类药

利用微生物发酵生产的品种：

维生素C的原料2-酮基-古龙酸、维生素A的前体β-类胡萝卜素、维生素D2的前体麦角甾醇、维生素B2（核黄素）、维生素B12（钴胺素）等。

（5）甾体类激素在甾体激素的生产过程中，一些特异的转化反应需要借助微生物的作用，详见第三章第三节内容。

（6）治疗酶及酶抑制剂药用酶主要有助消化酶类、消炎酶类，心管疾病治疗酶、抗肿瘤酶类以及其他酶类几类。

其中许多都可以用微生物发酵生产，如蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、链激酶、尿激酶、天冬酰胺酶、超氧化物歧化酶等。

由微生物产生的酶抑制剂有两种不同的概念。

一种是抑制抗生素钝化酶的抑制剂，叫做钝化酶抑制剂。

如抑制β-内酰胺酶抑制剂包括：

克拉维酸、硫酶素、橄榄酸、青霉烷砜、溴青霉烷酸等多种，这类酶抑制剂可以和相应的抗生素同时使用，以提高抗生素的作用效果。

另一种酶抑制剂是能抑制来自动物体的酶的抑制剂，其中有些可以降低血压，有的可以阻止血糖上升等，如淀粉酶抑制剂能使在服用糖时达到阻止血糖浓度增加的目的。

三、微生物发酵制药研究的发展趋势

应用微生物技术研究开发新药，改造和替代传统制药工业技术，加快医药生物技术产品的产业化规模和速度是当代医药工业的一个重要发展方向；

应用DNA重组技术和细胞工程技术开发的工程菌或新型微生物来生产新型药物：

治疗或预防心血管疾病、糖尿病、肝炎、肿瘤、抗感染、抗衰老以及计划生育方面的药物；

利用工程菌开发生理活性多肽和蛋白质类药物，如干扰素、组织纤溶酶原激活剂、白介素、促红细胞生长素、集落细胞刺激因子等；

利用工程菌研制新型疫苗，如乙肝疫苗、疟疾疫苗、伤寒及霍乱疫苗、出血热疫苗、艾滋病疫苗、避孕疫苗等。

第二节制药微生物与产物的生物合成（要求掌握）

一制药微生物的选择

符合要求的菌种一般可以从以下途径获得：

从菌种保存机构的已知菌种中分离；从自然界中分离筛选；从生产过程中分离筛选有益的菌种。

目的不同，筛选的方案也不同。

二制药微生物菌种的选育

药物高产菌种或分泌新型特效药物菌株的选育，包括自然选育和人工选育两种方法，后者又分诱变育种、杂交育种和基因工程育种等方法，其育种原理都是通过基因突变或重组来获得优良菌株。

1自然选育

自然选育就是在生产过程中利用微生物自然突变而进行优良品种选育的过程。

常用的自然选育方法是单菌落分离法，即把生产中应用的菌株或在试管中保存的菌株制成单细胞悬浮液，接种于适当的培养基上，培养后，挑取在初筛平板上具有优良特征的菌进行复筛，根据实验结果再挑选2～3株优良的菌株进行生产性实验，最后选出目的菌种。

自然选育方法虽然简单，但效率低、周期长，目前很少采用。

2诱变育种

凡是利用诱变剂处理分散而均匀的微生物群体，促进其基因发生突变的育种技术就称为诱变育种。

其中诱变剂是指能诱致基因突变，明显提高基因突变频率的理化和生物因素。

诱变结束后的筛选可以采用传统的随机筛选，也可以通过推理筛选，即根据产生菌的生物合成途径或遗传机制来设计筛选有效突变型的方法。

具体有

（1）前体及其类似物抗性突变株的筛选在微生物的代谢中，生理活性药物的生物合成均需要前体（包括外源性前体和内源性前体）。

微生物积累代谢产物的能力和利用前体的能力密切相关，当前体不足时产物合成量减少，但是当产物过量时往往会对微生物呈现毒性，或表现出反馈抑制调节作用。

因此筛选前体或其类似物抗性突变株，可以消除前体的毒性或反馈抑制作用，提高目的产物的产量。

（2）诱导酶系突变株的筛选许多微生物药物都属于次级代谢产物。

次级代谢产物在生长期不能合成。

如果通过诱变解除分解阻遏次级代谢基因的作用，或使诱导酶变成合成酶，使得微生物在生长期即能合成产生次级代谢产物的诱导酶，则在生产中可以大大缩短发酵周期。

（3）分解产物的酶缺失突变株的筛选许多微生物在体内合成某种产物时，同时也产生能分解该产物的酶，导致产物不稳定，浓度低，因此这种菌必须通过诱变使分解产物的酶出现缺失突变。

（4）形态突变型有些生理活性物质生产菌株的形态变异（如菌体颜色、孢子的产生和色素）和生产能力变化存在密切的关系。

这些形态的变化往往受质粒调控，因此用诱变剂尤其是质粒消除剂处理生产菌株时，能高频率出现形态变异，且容易出现高产突变株。

（5）膜渗透突变型通过诱变选育能抗抑制细胞膜合成物质的突变株，可改变细胞膜的渗透性，从而使微生物摄取营养物质、分泌代谢产物的能力提高，导致代谢产物增产。

（6）代谢途径障碍突变型由于微生物体内存在着许多不同的代谢途径，有些途径有共同的前体，因此为积累某一种代谢产物，可通过诱变选育一些合理的营养缺陷型菌株截断不必要代谢途径，使共同前体专一向目的产物的合成方向进行。

如果目的产物并非代谢途径的末端产物，还应阻断目的产物以下的多余代谢途径。

这样通过代谢途径障碍突变型的筛选即可以获得高产目的产物的菌株。

另外，突变株有时会发生变异，在传代过程造成一些低发酵活力的菌占有主导地位，最终导致菌种不纯，因此经常性地进行自然分离和诱变育种是生产正常进行的一个保证。

三微生物代谢产物的生物合成

（一）研究代谢产物生物合成常用的方法

1同位素示踪法

同位索示踪法的基本过程是将由同位素标记的化合物（如14C-葡萄糖）提供给试验菌、使标记化合物参与某种代谢产物的形成，然后测定产物或中间产物的同位素含量，从而判断试验化合物是否参与代谢物的生物合成。

2遗传特性诱变法

遗传特性诱变法又称自养体突变株法，该法通过常规的诱变方法处理能够产生菌种代谢产物的试验菌，使突变菌株不能合成该代谢产物或其中间代谢物，即所谓的负突变株。

这些突变株能够积累某种中间代谢产物或支路代谢产物，因此可以通过比较正常微生物菌和其突变株代谢产物化学结构上的差异，推断出某种代谢产物的生物合成的反应步骤，然后再分离其反应中的特殊酶类，进一步判断其生化反应的特性。

3洗涤菌体悬浮法

试验时取不同生长阶段的菌体，洗去沾染原培养基内的作用物后，把菌体悬浮在人工培养系统内，在一定条件下继续观察被试验化合物对菌体代谢和对代谢产物合成的影响。

为避免菌体内含物的干扰，常把洗净后的菌体悬浮在生理盐水中，继续保温一定时间，尽可能使其内源营养物耗竭，然后再在人工培养系统进行试验，即饥饿后试验。

采用此法，被试验的菌体仍能以基础原料合成某种代谢产物，不过产量会大大减少，但仍可判断生物合成过程中的一些步骤。

4无细胞酶系统法

用适当的方法（如超声波破碎等）破碎细胞，释放胞内酶，再经过离心和冷冻干燥，即为酶制品。

这种酶制品中往往含有多种酶体系，能引起多种生化反应，但可根据所分离酶和杂酶的性质不同，除去杂酶的干扰，制得纯酶，即为无细胞酶系统。

然后将有关物质加入反应体系，适当条件下保温—定时间后，检测反应体系中酶促反应产物和底物的浓度，进而判断该酶是否对代谢产物的生物合成起催化作用。

5刺激试验法

在某种代谢产物的发酵培养基或发酵过程中，添加一些可疑的前体物质，观察该物质在发酵过程中的利用情况和促进代谢产物生物合成的效果。

（二）微生物初级代谢产物的生物合成（略）

具体见生物化学等有关书籍。

（三）微生物次级代谢产物的生物合成

1微生物合成次级代谢产物的基本特征

微生物的次级代谢产物在生物活动过程中，都要以初级代谢物作为前体物，并受初级代谢的调节作用。

但是次级代谢产物具有种的特异性，有些微生物能合成多种次级代谢产物，而有些微生物能产生同样的产物，这些微生物菌种在分类学上的位置与产生次级代谢产物的结构之间没有明确的内在联系。

其次，进行次级代谢的产生菌能同时合成多种结构相似的次级代谢产物。

另外，次级代谢产

物一般在菌体的生长后期合成，但是在发酵的每个过程所需要营养成分和发酵条件均不同。

2次级代谢产物的生源

在研究次级代谢产物生物合成过程中，常用到两个不同的术语，即生物合成和生源。

生物合成是指用于描述在生物体内次级代谢产物的形成过程。

生源则是强调次级代谢产物分子的装配单位的来源。

一般次级代谢产物的生源都是直接或间接地来自于微生物代谢过程中产生的一些中间产物和初级代谢产物。

次级代谢产物合成中常用的生源：

（1）聚酮体即含有多个羰基的聚合物，和初级代谢产物脂肪酸合成的前体相似。

许多次级代谢产物（如四环素抗生素的苯并体、大环内酯类抗生素的内酯环以及蒽环类抗生素的蒽醌环）的前体物是由聚酮体构成。

组成聚酮体的基本单位为乙酸、丙酸、丁酸和短链脂肪酸，

起始单位有乙酰辅酶A、丙酰辅酶A、丙二酰胺辅酶A和丁酰辅酶A等，

聚酮体链的延伸单位有丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A，分别是二碳、三碳和四碳的供体。

聚酮体的形成以起始单位为基础，与链的延伸单位不断缩合和脱羧，最终形成β-多酮次甲基链，聚酮体链的长短及其链的饱和程度随微生物种类不同而差别很大。

合成的β-多酮次甲基链经过不完全的还原或者在不同位点还原，可以形成种类极多的聚酮体。

这些反应是附着于酶的表面完成的，而不是在细胞质中以游离态进行的。

（2）糖类次级代谢产物中的糖类主要有氨基糖、糖胺、核糖、环多醇和氨基环多醇以及其他糖类等。

微生物在发酵过程中，可以利用的碳源有单糖、双糖以及少数糖等，但是在被微生物吸收时，必须先降解成以葡萄糖和戊糖为主的单糖，因此在次级代谢产物结构中，主要以葡萄糖和戊糖为前体，形成次级代谢产物所得要的各种糖类和氨基糖。

（3）不常见的氨基酸正常氨基酸是指微生物能够直接利用并用于蛋白质合成的α-L-氨基酸，而在次级代谢产物中存在有200多种非蛋白质氨基酸，如D-氨基酸，N-甲基氨基酸、β-氨基酸以及稀有的二氨基酸等，称为不常见的氨基酸。

这些非蛋白质氨基酸在次级代谢产物中占到一半以上，可以由正常的氨基酸异构或修饰而得，也可以通过葡萄糖的初级代谢产物合成。

（4）非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱不同于正常核酸上的碱基，而是以正常碱基经过化学修饰形成的。

与菌体内核苷酸的合成途径不同，可以直接利用培养基中的各种嘌呤碱基核苷酸。

而嘧啶核苷酸类抗生素的生物合成中，嘧啶环的前体物质由胞嘧啶提供。

（5）吩恶嗪酮吩恶嗪酮是—些次级代谢产物的一个基本结构，如放线菌素的发色团中就具有一个吩恶嗪酮结构，其生物合成的前体是色氨酸和一些代谢物。

它们先形成4-甲基-3-羟基-邻氨基苯酸，然后两分子的4-甲基-3-羧基-邻氨基苯酸在吩恶嗪酮合成酶的催化下被氧化脱水形成吩恶嗪酮。

（6）利福霉素S对于安莎类抗生素，利福霉素是其合成过程中一个重要的中间体，它可继续衍生成该族其他抗生素。

利福霉索S是由甲基丙二酸、乙酸和丙二酸单元构成，分子结构中的两个甲基来源于甲硫氨酸。

其生物合成是从一个七碳氨单位（该结构由糖降解代谢物按—般芳香化合物合成的途径形成）开始，再按聚酮体链延伸的途径合成其他部分。

（7）甲羟戊酸在许多次级代谢产物中，甲羟戊酸是其重要的构建单位。

如甲羟戊酸被磷酸化后形成甲羟戊酸-5-焦磷酸，继续经脱羧和脱水作用就可以形成活化形式的异戊二烯焦磷酸，这种活化的五碳单位几乎可以任何数量的单元结合，形成各种各样的异戊二烯类或萜类次级代谢产物。

3次级代谢产物生物合成的基本途径（略）

一般次级代谢产物合成的基本途径包括：

前体聚合、结构修饰和不同组分的装配。

四、微生物生物合成的主要调节机制

了解微生物生物合成的主要调节机制，有助于育种方案的选择和发酵工艺的优化。

（一）次级代谢浏产物和初级代谢产物之间的关系

1都受菌体代谢调节，初级代谢接受菌体调控比次级代谢更严格一些。

2从生化代谢看，次级代谢产物的化学结构多种多样，但是其生源是由少数几种初级代谢产物构成，是以初级代谢产物为母体衍生而来。

3在代谢过程中还存在着许多分叉中间体，它们既可用来合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物。

4从遗传代谢看，初级代谢和次级代谢同样都受到核内DNA调控，同时相当一部分次级代谢产物的代谢还受核外遗传物质质粒的控制，因此两者在遗传代谢上既有相同的部分，又有不同的部分。

5次级代谢的生理功能：

首先，它可以维持初级代谢的平衡，将初级代谢积累下来的中间产物进行另种形式的转化，从而消除物质过量对细胞的不利；其次，次级代谢产物是贮存初级代谢物质的一种形式，当然并不是所有的次级代谢产物都是一种贮藏物质；某些次级代谢产物可以抑制或杀死其他微生物，使自己在生存中占优势。

还有一些次级代谢产物与微生物细胞的分化有关。

（二）初级代谢产物的主要代谢调节机制

初级代谢产物生物合成过程中调节类型包括酶的活力调节和酶合成调节，两种调节方式在菌体内协同进行。

1酶活力调节

（1）酶激活作用酶代谢激活作用主要是指代谢物对酶的激活，包括前体激活和代谢中间产物的反馈激活两种情况。

前体激活是指代谢途径中后面的酶促反应可被此途径前面的一个中间产物所促进，例如粪链球菌的乳酸脱氢酶的活力，可以被前体物质1,6-二磷酸果糖促进。

代谢中间产物反馈激活是指代谢中间产物对该代谢途径的前面酶起激活作用，这种激活的方式并不多见，比较著名的例子是1，6-二磷酸果糖是磷酸果糖激酶的激活剂。

（2）酶抑制作用在代谢调节过程中所发生的抑制现象大多数属于反馈抑制。

反馈抑制是指代谢的末端产物对酶活力的抑制，类型如下：

无分支代谢途径的调节：

通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活力有抑制作用。

有分支代谢途径的调节：

即有两种或两种以上的末端产物，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用，其调节方式包括酶的顺序反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制和增效反馈抑制（图5—5）。

2酶合成调节

酶合成调节是通过酶量的变化来控制代谢的速率，是在基因水平上起作用，包括酶合成的诱导和阻遏两种类型。

（1）酶合成的诱导通过诱导合成的酶称为诱导酶，这种酶只有在补加相应诱导剂（底物）时才能大量合成。

酶合成的诱导作用可表现出协同诱导和顺序诱导两种情况。

协同诱导是指一种诱导剂可以同时诱导产生若干个酶的现象。

顺序诱导是指一种诱导剂可以连续诱导产生一系列酶的现象。

（2）酶合成的阻遏阻止酶合成的现象即为酶合成的阻遏，其中阻遏酶合成的物质称为阻遏物。

酶合成的阻遏分为终点产物反馈阻遏和分解代谢物的阻遏两种类型。

前者是指被阻遏物阻遏合成的酶所催化生成的物质为代谢的终点产物；而后者是指一些被菌体迅速利用的底物或其分解的产物对许多酶合成的抑制作用。

分解代谢物阻遏根据底物不同，可分为碳分解产物阻遏和氮分解产物阻遏，即指一些被菌体能够迅速利用的碳源或氮源能阻遏其他某些参与含碳或含氮化合物代谢的酶的合成。

3能荷调节

能荷是表示细胞中的能量状态，是指细胞内全部腺苷酸中含有相当于ATP数量的百分比，可按下式汁算：

EC（％）＝[（[ATP]十l/2[ADP]）／（[ATP]十[ADP]十[AMP]）]×100

在糖的分解代谢中从某种意义上讲，可以把ATP视为代谢的末端产物，那么ATP过量时会对合成ATP的系统产生反馈抑制，如果ATP分解为ADP和AMP，将其能量用于合成反应时则ATP的反馈抑制被解除，ATP的合成又得到恢复。

因此当能荷降低时，则激活催化糖分解代谢中的某些酶或解除ATP对这些酶的抑制（糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶等），并抑制糖原合成酶和1,6-二磷酸果糖酯酶的活力，加速糖酵解和三羧酸循环的产能过程。

当能荷较高时，细胞中AMP和ADP大都转化成ATP，则ATP就抑制糖原降解和糖酵解、三羧酸循环的关键酶，并激活糖类的合成酶，即抑制糖分解而加速糖合成。

（三）次级代谢产物的主要代谢调节机制

1初级代谢对次级代谢的调节

当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成。

这主要是因为初级代谢终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。

2碳代谢物的调节

一般情况下，凡能促进产生菌生长速度的碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用。

即具有次级代谢的微生物在生长过程中，不进行次级代谢产物的合成，主要由于碳分解产物产生阻遏作用的结果。

菌体在生长阶段，速效碳源如葡萄糖和柠檬酸等的分解产物，可阻遏次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。

3氮代谢物的调节

在不同氮源的研究中发现，以蛋白质作氮源，可以促进次级代谢产物的合成，而以无机氮或简单有机氮等容易利用的氮作为氮源（胺盐、硝酸盐、某些氨基酸），能促进菌体的生长，但却抑制次级代谢产物的合成。

4磷酸盐的调节

过量的磷酸盐也像葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用称为磷酸盐调节。

磷酸盐对次级代谢产物合成的影响表现在以下几个方面：

（1）抑制次级代谢产物前体的形成；

（2）阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成；（3）抑制碱性磷酸酯酶的合成；（4）增加菌体能荷状态以及促进初级代谢。

5ATP调节

在四环素的生物合成中，菌体内ATP水平对四环素合成起调节作用。

因为其合成前体丙二酰CoA有两条合成途径，其中一条是通过磷酸烯醇式丙酮酸经丙酮酸生成乙酰CoA后，在乙酰coA羧化酶的作用下生成丙二酰CoA，此途径在菌体生长期占主导地位；另一条途径则是磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用下生成草酰乙酸，再经羧基转移酶作用生成丙二酰CoA，此途径在四环素合成期起决定作用，因此强化第二条途径有利于四环素的合成。

而第二条途径中的草酰乙酸是TCA循环中的重要中间产物，催化形成它的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和过量无机磷的强烈抑制，降低了草酰乙酸的生成。

最终降低了四环素合成的前体物丙二酰CoA的浓度。

6诱导调节和产物的反馈调节

诱导调节：

在次级代谢过程中，有些酶为诱导酶，需要有诱导物才能形成。

产物的反馈调节：

在次级代谢产物合成中，产物的过量积累，也存在着像初级代谢中相似的反馈调节现象。

7细胞膜透性调节

8金属离子和溶解氧的调节

在多数情况下，微量的金属离子是次级代谢中合成酶的活化因子，甚至有时在转录和转译水平上起作用。

另外一些金属离子（如Mg2+和Ca2+等）可以解除产生菌（卡那霉素、新生霉素和链霉素等产生菌）对所产抗生素特异吸附的作用，使抗生素从菌丝上游离下来，甚至—些金属离子（Mg2+）可增加产生菌对所产抗生素的抗性。

次级代谢产物的发酵过程需要适量的溶解氧，例如在利用无细胞体系由青霉素N进行头孢菌素合成时，随着氧分压的增大而被促进，同时加入KCN或降低搅拌速度则合成量减少。

第三节发酵工艺条件的确定（要求掌握）

一培养基及其制备

培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。

培养基的组成和配比是否恰当对微生物的生长、产物的合成、工艺的选择、产品的质量和产量等都有很大的影响。

（一）培养基的成分

药物发酵培养基主要由碳源、氮源、无机盐类、生长因子和前体物等组成。

1碳源

碳源是组成培养基的主要成分之—。

其主要作用是供给菌种生命活动所需要的能量；构