14寄生虫检测作业指导书除疟原虫.docx

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14寄生虫检测作业指导书除疟原虫

14寄生虫检测作业指导书（除疟原虫）

　　　　　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　　　版号：

第2版　　　　　　文件编号：

PLCDCW031014　　　　寄生虫检测作业指导书　　　　　　　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施　　蓬莱市疾病预防控制中心　　编写、修改记录　　第1页共4页　　　　编写人：

张国英　　完成编写日期：

2009年08月01日审核人：

何茂祥　　审核日期：

2009年08月03日批准人：

袁文兴　　批准发布日期：

2009年08月06日版号：

第2版　　　　修订次：

第0次修订修改处修改内容修改人批准人生效日期蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

PLCDCW031014　　版号：

第2版　　　　　　第2页共4页　　索引：

A蛔虫、鞭虫、蛲虫、钩虫、姜片虫、血吸虫、肺吸虫、华支睾吸虫检查方法　　B阿米巴痢疾病原学诊断方法　　C血吸虫检查D肺吸虫检验E华支睾吸虫检验F牛、猪肉绦虫检验：

G丝虫检验　　H旋毛虫检查I蚧螨检查　　J蠕形螨及其它螨类检查：

H阴道毛滴虫检查（悬滴法）　　A蛔虫、鞭虫、蛲虫、钩虫、姜片虫、血吸虫检查方法1采用改良加藤厚涂片法进行病原学检查。

、改良加藤厚涂片法操作步骤1材料的准备　　塑料定量模板（统一供应）：

规格为30mm×40mm×1mm的聚苯乙烯模板，中央孔为圆台形，其短径3mm，长径4mm，高1mm，容积为；软性塑料刮片（统一供应）：

两头刮片型；　　尼龙绢片（统一供应）:

规格为80～100目，裁剪成8cm×8cm大小；　　透明液的配制：

取100ml蒸馏水、100ml纯甘油、3%的孔雀绿1ml，按此比例混合均匀；　　亲水性透明玻璃纸（统一供应）：

规格为30mm×25mm、厚40μm，使用前需在透明液中浸泡24小时以上，使玻璃纸显示绿色或蓝色；　　载玻片：

规格为75mm×，厚～；　　其它：

原始登记表、镊子、剪刀、记号笔、标本盒、吸水纸、光学显微镜和一次性手套等。

　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

PLCDCW031014　　版号：

第2版　　　　　　第2页共4页　　2操作步骤　　编号：

每份粪样取1张载玻片进行编号；　　打开待检粪样的包装，将尼龙绢片置于待检粪样上，用塑料刮片轻压尼龙绢片并在其上轻刮，使细粪渣透过尼龙绢片的微孔滤出至绢片表面；　　将定量板放在载玻片中部，然后用刮片将绢片表面的细粪渣填入定量板的中央孔内，使填满全孔并抹平；　　小心移去定量板，使粪样留在载玻片上；　　取一张浸泡好的亲水玻璃纸，抖掉多余的浸泡液，盖在粪样上，用橡皮塞或另一块较厚的载玻片覆于玻璃纸上垂直均匀用力压制，使粪便均匀地展开至玻璃纸边缘；待粪便透明后及时镜检。

3结果观察　　将透明后的加藤片置于光学显微镜的载物台上，在低倍镜下进行镜检。

镜检时仔细检查每一视野，并特别注意受精蛔虫卵与未受精蛔虫卵的鉴别。

虫卵计数方法　　每张涂片发现的蛔虫卵、鞭虫卵、钩虫卵、其他吸虫卵都要计数。

镜检所用显微镜统一目镜为10×的镜头。

于一些地区蛔虫感染度特别重，有时一张涂片虫卵数达数千甚至数万个，计数蛔虫卵比较费时，为此对蛔虫卵计数作以下规定：

每张涂片首先随意粗查几个视野，若每个视野蛔虫卵数在10个以上，可以暂不计数蛔虫卵。

先读完全片各视野的钩虫卵数和鞭虫卵数等，再用定视野抽查法推算全片蛔虫卵数。

具体步骤是：

　　按下图分布固定抽查10个视野，并算出抽查的10个视野蛔虫卵总数；　　10个视野分布图　　计算出该涂片粪膜视野数，再推算出全片蛔虫卵数。

　　按一定的规律，如自左而右，自上而下，再自右而左，一行接一行，一个视野接一个视野地　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

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第2版　　　　　　第2页共4页　　用推行器移动涂片，数出全片粪膜视野数，则：

　　全片粪膜蛔虫卵总数＝抽查的10个视野蛔虫卵数之和×全片粪膜视野数÷10例：

抽查的10个视野蛔虫卵数相加为366，全片粪膜视野数为78，则：

全片粪膜蛔虫卵总数＝366×78÷10＝≈2855　　结果登记　　观察的结果即时记录在原始登记表上，并及时转登附表1。

4注意事项　　亲水性透明玻璃纸：

使用前需全部浸入透明液中，浸泡24小时以上。

　　把刮片上的细粪渣填入定量板时，必须填满中央孔全孔并抹平；压制涂片时尽量使粪便均匀展开至玻璃纸边缘，但应避免粪渣溢出。

　　涂片放置时间长短是确保镜检质量的关键。

一般室温25℃、75%湿度以下，涂片放置时间不宜超过2小时；若温度低，空气湿度大，涂片放置时间可适当延长。

总之，涂片放置时间取决于粪样透明度，只要透明了，就应及时镜检，否则透明过渡，薄壳虫卵易变形看不清楚，会造成漏检或误判。

　　用椭圆孔塑料定量板，每孔所容粪便重量平均，每片所得虫卵数乘以24，即得每克粪便的虫卵数。

粪检时每片虫卵数不必乘24，填在附表1的数值为实际数的虫卵数。

　　粪样一送三检，三片全计数后取平均值。

　　B阿米巴痢疾病原学诊断方法　　直接涂片法　　取洁净载物玻片一张，在其中央滴生理盐水1～2滴。

　　用竹签挑取一小块粪便，在盐水中涂抹成一个直径为1cm粪便薄膜。

其厚度以通过粪便薄膜能看清书报上的字为宜。

　　盖上盖玻片后，显微镜下观察。

　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施

　　　　　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

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第2版　　　　　　第2页共4页　　碘液玻片法涂片制法同，仅用碘液代替生理盐水而制涂片。

包囊呈棕色，未成熟包囊的糖原泡呈棕色，核与囊壁不着色而透明。

　　铁苏木素染色法　　用新鲜粪便于载物玻片上制成薄膜。

　　立刻放入热至40℃邵氏固定液中，约3～5min.固定液温度低于40℃时需15～30min。

　　再放入70％酒精中5～10min，然后移至70％碘酒精脱汞10min以上，使涂片变为棕色。

　　放入70％酒精中1h或过夜，再放入50％酒精中5min。

　　用流水轻轻冲洗10min，再用蒸馏水冲洗。

　　放入热至40℃20g/L的铁明矾溶液中媒染2min或40g/L的铁明矾溶液中1～6h，自来水冲洗5min。

　　移入5g/L的苏木素染色液中1至数小时或过夜，自来水冲洗5min。

　　再放入20g/L的铁明矾溶液中20min，至颜色适当，细胞核清晰可见为止，再以流水冲洗5min。

　　依次放入50％、70％、80％、90％、95％、100％酒精中各2～10min。

　　放入二甲苯和纯酒精各半的溶液中及纯二甲苯中各约2min，以透明之。

　　用中性树胶封片、干燥、镜检。

　　染色结果　　滋养体的核膜呈深蓝黑色，核仁与核膜之间清晰，核膜内染色质粒分明，细胞质蓝色，食物泡内含物为深蓝色。

包囊为蓝色，核与滋养体清晰可见。

红细胞呈红色，拟染色体呈深蓝黑色，糖原泡在染色过程中被溶解成空泡。

　　培养检查法　　采取粪便标本，务求新鲜，所用器皿清洁干净。

尿液或水勿混入粪便或容器内。

　　标本采集，应选择脓血及粘液部分；比较正常的粪便，要采取不同部位。

成形或半成形便应采取5～10g，放入便盒。

液质或半液质粪便，可用小勺装入试管或标本瓶中。

任何　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

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第2版　　　　　　第2页共4页　　容器均应加盖，容器外面切勿沾染粪便。

　　粪便采集后，应立即送检，务必在2h内进行检查。

　　培养方法　　成形或半成形便，用灭菌的接种环取豌豆大小，接种于培养基的液体部分，并在管壁上轻轻研磨，使粪便混匀于液内。

　　液质或半液质粪便则用灭菌吸管，吸取粪液，接种培养基的液体部分中。

　　放入37℃温箱，培养48h，用吸管取沉淀物一滴，作涂布检查。

方法见。

　　若检查结果为阴性，应从培养管底部吸取沉淀物转种另一培养基中，再经48h培养后检查，仍为阴性，报告。

　　C血吸虫检查间接红细胞凝集试验　　抗原：

为用葡聚糖凝胶G100初步纯化的SE8致敏的绵羊红细胞。

所用绵羊红细胞先经%戊二醛化及1：

5000鞣酸溶液鞣化后再行致敏。

致敏后的红细胞以含10%蔗糖及1%正常兔血清的配5%悬液，分装安瓿低压冻干封存。

每批致敏红细胞作效价测定，滴度达1：

1280～1：

2560为合格。

抗原也可采用SE8和8U8的混合抗原；血球也可采用人“O”型红细胞。

操作方法　　启开安瓿，每支以1ml蒸馏水稀释混匀备用。

　　用微量滴管加4滴生理盐水于微量血凝反应板第一排第二孔内，第三孔空白，第四孔加1滴。

　　第一孔内储存待检血清，并从中吸取血清1滴加入第二孔内，充分混匀后，吸出两滴于第三孔和第四孔各加1滴。

在第四孔混匀后弃去1滴使第三孔、第四孔血清稀释度为1：

5，1：

10。

　　用定量吸管吸取致敏红细胞悬液，于第三孔和第四孔内各加1滴，立即旋转震摇2min,室温下静置1h左右，观察结果。

　　每次试验均应有阳性血清作阳性对照，生理盐水作阴性对照。

　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

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第2版　　　　　　第2页共4页　　结果判断　　阴性反应为红细胞全部沉入孔底，肉眼见一边缘光滑，致密的小圆点。

阳性反应：

　　＋＋＋＋红细胞形成薄层凝集，边缘呈现不规则的皱褶。

＋＋＋红细胞形成薄层凝集，充满整个孔底。

＋＋红细胞形成薄层凝集，面积较“＋＋＋”者小。

　　＋红细胞大部分沉集于孔底，形成一圆点，周围有少量凝集的红细胞，肉眼见周边模糊。

　　反应标准：

以血清1：

10稀释出现凝集反应可判为阳性。

酶联免疫吸附试验　　抗原或抗体：

常用SE8包被载体检测抗体，亦可用单克隆抗体包被载体以检测抗原。

操作方法　　于微量聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板的凹孔中加入100μl以碳酸盐缓冲液稀释的SE8或单克隆抗体，置4℃过夜。

　　次日倾去抗原，用含有%吐温－20的磷酸缓冲盐水洗涤3次，每次5min。

　　于凹孔中加入以P4S-T作1：

100或1：

200稀释的受检者血清及参考血清100μl，37℃，1h。

倾去血清，以P4S-T洗涤3次，每次5min。

　　加入以P4S-T作1：

1000或1：

4000稀释的辣根过氧化物酶-标记结合物100μl，37℃，1h。

　　倾去酶标记结合物，以P4S-T洗涤3次，每次5min。

　　加入100μl已加H2O2的邻苯二胺或四甲基联苯胺底物溶液，37℃，30min。

　　在各凹孔中加入2mol/L硫酸50μl以终止反应。

　　在酶标专用比色计上读取492nm或450nm光密度　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

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第2版　　　　　　第2页共4页　　值，以P/N≥倍判为阳性。

胶体染料试纸条法试验抗原：

胶体染料标记的血吸虫SE8。

操作方法　　轻轻混匀抗原贮存管中胶体染料标记的抗原液。

　　加50μl标记液至PVC小杯中，再入10μl待检血清，缓缓混匀1min。

　　取试纸条插入小杯中，约10min左右，待对照带区出现紫蓝色反应带，即可判断结果。

结果判断　　以检测带区和对照带区均出现紫蓝色反应带为阳性；以对照带出现紫蓝色反应带，而检测带区无反应为阴性。

　　环卵沉淀试验　　虫卵：

热处理超声干燥虫卵粉。

以重感染兔血清测试环沉率＞30%为合格。

　　操作方法：

先用熔化的石蜡在洁净的载玻片两端分别划两条相距20mm的蜡线，在蜡线之间加受检者血清2滴，然后用针头挑取干卵约100个～150个，加入血清中，混匀，覆以24mm×24mm盖玻片，四周用石蜡密封后，置于37℃温箱中，经48h～72h后用低倍显微镜观察反应结果，疑似者应在高倍显微镜下加以识别。

　　为简化操作亦可选用预制的有双圆孔的双面胶纸条，只需在圆孔中加入干卵和50μl血清，覆以盖玻片，置37℃孵箱中48h，观察结果。

或选用预制干卵PVC膜片，只需加入血清，置湿盒中37℃保温经24h取出，倾去血清，加少量盐水显微镜下观察反应。

　　反应标准：

典型的阳性反应虫卵周围有泡状、指状或细长卷曲的带状沉淀物，边缘较整齐，有明显的折光。

其中泡状沉淀物须大于10μm，才能定为阳性。

阳性反应的标本片，应观察100个成熟虫卵，计算其沉淀率；阴性者必须看完全片。

阴性反应：

虫卵周围光滑，无沉淀物；或有小于10μm的泡状沉淀物。

阳性反应的强度和环沉率：

　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

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第2版　　　　　　第2页共4页　　“＋”虫卵周围出现泡状、指状沉淀物的面积小于虫卵面积的1/4；细长卷曲的带状沉淀物小于虫卵的长径。

　　“＋＋”虫卵周围出现泡状、指状沉淀物的面积大于虫卵面积的1/4；细长卷曲的带状沉淀物相当于或超过虫卵的长径。

　　“＋＋＋”虫卵周围出现泡状、指状沉淀物的面积大于虫卵面积的1/2；细长卷曲的带状沉淀物相当于或超过虫卵长径的2倍。

　　计算环沉率=阳性虫卵数/全片观察成熟虫卵数×100%环沉率≥3%时，判为阳性。

斑点金免疫渗滤试验抗原：

1%血吸虫SE8操作方法　　在小盒中央膜上加4液2滴，待渗入。

加待检血清25μl，待渗入。

加4液2滴，待渗入。

　　加入8液2滴，待渗入。

加4液2滴，待渗入。

　　结果判断：

在膜上显示红色斑点为阳性，仅留白色背景为阴性。

色泽接近标准阳性者为＋，色泽与阳性血清一致者为＋＋，色泽深于标准阳性者为＋＋＋。

粪便检查　　尼龙绢袋集卵孵化法　　操作步骤：

取受检者粪便约30g，先置于40目～60目/的铜丝筛中，铜丝筛置于下口夹有铁夹的尼龙绢袋口上，淋水调浆，使粪液直接滤入尼龙绢袋中，然后移去铜丝筛，继续淋水冲洗袋内粪渣，并用竹筷在袋外轻轻刮动助滤，直到滤出液变清。

取下夹于袋底下口的铁夹，将袋内沉渣淋入三角烧瓶。

如需加做沉淀镜检，可在烧瓶中吸取沉渣3滴～4滴放在载玻片上，抹成涂片，涂面应占载玻片面积的2/3。

涂片的厚度以能透过涂片尚能看清印刷字体为标准，将涂片置于低倍显微镜下检查。

全片镜检时间不宜少于2min，　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施

　　　　　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

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第2版　　　　　　第2页共4页　　每份粪便至少检查两张涂片，镜检时应仔细识别血吸虫卵和其他蠕虫卵。

然后将盛有粪便沉渣的三角烧瓶加水至离瓶口1cm处，放入孵化室或在室温下孵化。

一定时间后取出烧瓶，观察毛蚴。

一般需观察2次～3次，观察时间随温度高低而不同。

温度高时孵出较早；温度低时毛蚴孵出迟。

气温超过30℃时，第1次观察可在～1h后进行，阴性者可在4h后观察第2次，8h观察第3次，3次均为阴性者，判作阴性结果；气温在26℃～30℃时，可在孵化后4h开始观察，阴性者8h及12h再观察1次；气温在20℃～25℃时，则可在8h后观察第1次，12h后观察第2次；如利用自然气温孵化，一昼夜之间的气温悬殊，可在操作后的次晨再观察1次。

一般室温在25℃以上时，可利用自然气温孵化，无需加温。

观察毛蚴时，应将烧瓶向着光源，并衬以黑纸板。

要注意毛蚴与水中原生动物的区别。

如有怀疑，可用毛细吸管吸出，在显微镜下鉴别。

改良加藤厚涂片法　　操作步骤：

置尼龙绢片于受检粪样上，用软性塑料刮片在尼龙绢片上轻刮，粪便细渣即绢片微孔中露至绢片表面。

将定量板放在载玻片中部，以刮片从尼龙绢片上刮取细粪渣填入定量板的中央孔中，填满刮平。

小心提起定量板，粪样即留在载玻片上。

取一张经甘油-孔雀绿溶液浸渍24h的亲水性玻璃纸，盖在粪便上，用橡皮塞或另一块载玻片覆于玻璃纸上轻压，使粪便均匀展开至玻璃纸边缘。

编号后置于25℃室温，相对湿度75%下过夜，镜检。

否则会因透明过度而漏检。

每份粪样至少需做2张涂片，以镜检每片平均检出的虫卵数乘以24即为1g粪便中的虫卵数。

集卵透明法　　操作步骤：

将粪便充分搅匀后，取5g置于搪瓷杯中，加水调成粪液。

把粪液通过60目/的铜丝筛淋水滤入2只套叠在一起的尼龙袋中。

然后移去铜丝筛，继续淋水冲洗袋内粪渣，并把袋轻轻振荡，使加速过滤，直至滤出液变清为止。

用药勺刮取外袋内全部沉渣，分作涂片。

在沉渣图片上，覆盖经甘油-孔雀绿溶液浸渍24h的亲水性玻璃纸，以玻片压匀，置室温中过夜，次日镜检。

以全部沉渣获得的虫卵数相加，再除以5得出每克粪便中虫　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

PLCDCW031014　　版号：

第2版　　　　　　第2页共4页　　卵数。

D肺吸虫检验病原诊断　　⑴痰或粪便虫卵检查：

查获并殖吸虫虫卵可确诊。

⑵活检：

皮下包块或结节手术摘除可能发现童虫，或典型的病理变化。

免疫试验　　⑴皮内试验：

常用于普查，阳性符合率可高达95％以上，但常有假阳性和假阴性。

⑵酶联免疫吸附试验：

敏感性高，阳性率可达90％～100％。

　　⑶循环抗原检测：

近期应用酶连免疫吸附抗原斑点试验直接检测血清中循环抗原，阳性率在98％以上，且可作为疗效评价。

E华支睾吸虫检验　　病原学检查粪检找到华支睾吸虫卵是确诊的根据，一般在感染后1?

个月可在大便中发现虫卵，常用的方法有　　

（1）涂片法：

直接涂片法操作虽然简便，但于所用粪便量少，检出率不高，且虫卵甚小，容易漏诊。

定量透明法，在大规模肠道寄生虫调查中，被认为是最有效的粪检方法之一，可用于虫卵的定性和定量检查。

（2）集卵法：

此法检出率较直接涂片法高。

集卵法包括漂浮集卵法和沉淀集卵法两类，沉淀集卵常用水洗离心沉淀法，乙醚沉淀法。

　　F牛、猪肉绦虫检验：

　　对可疑的患者应连续数天粪便检查，必要时还可试验性驱虫。

收集患者的全部粪便，用水淘洗检查头节和孕节可以确定虫种和明确疗效。

将检获的头节或孕节夹在两载玻片之间轻压后，观察头节上的吸盘和顶突小钩或孕节的子宫分支情况及数目即可确诊，并与牛带绦虫相鉴别。

　　G丝虫检验厚血膜法　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施　　蓬莱市疾病预防控制中心　　作业指导书　　寄生虫检测作业指导书　　文件编号：

PLCDCW031014　　版号：

第2版　　　　　　第2页共4页　　血片制作：

于晚9时至翌晨2时，以酒精棉球消毒耳垂（或指端）待干，用三棱针快速深刺，轻挤出血液，取血3大滴，约等于60μL，置于已编号的清洁载玻片上，涂成边缘整齐、厚薄均匀的椭圆形或长方形厚血膜（约长3cm、宽），平放于有盖的玻片盒内，以防落灰或虫吃。

　　血片染色：

次日，将经自然干燥的血片放入清水中溶血5～10min，至血膜呈乳白色，取出晾干，甲醇固定，染色。

大规模普查可用硼砂美蓝染色，鉴定虫种及保存宜用吉氏液或苏木素染色。

　　硼砂美蓝染色法：

取美蓝2g，硼砂3g，置研钵内，边研边加水，待溶解后冲洗入瓶中，加蒸馏水100mL配成原液，过滤后放置备用。

染色时取原液5mL加清水配成5％稀释液，染3～5min，使血膜呈天蓝色，然后用清水轻轻冲洗。

本法染色前可不必先溶血、固定。

吉氏染色法：

染液吉氏粉，中性甘油25mL及甲醇25mL配成。

先置染粉于研钵内，加少量甘油充分研磨，边研边加，至甘油加完为止，然后倾入100mL玻塞瓶内，用甲醇小量多次洗涤甘油染液倾入瓶内，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于55～60℃温箱内24h或室温下3～5天，即为原液，放置愈久染色效果愈佳，临用时稀释。

将溶血后已干的血片用甲醇固定约1min，然后滴加10％染液（原液加清水稀释配成）染45min，用蒸馏水轻轻冲洗。

德氏苏木素染色法；染液A液即铵明矾饱和液（铵明钒20g、蒸馏水100mL）；B液（苏木素结晶1g加纯酒精10mL）；C液（甘油25mL加甲醇25mL）配成。

将B液逐滴加入A液中，倒入一不盖紧的容器内，置于空气流通处，经2周至1个月使其充分氧化，过滤后加入C液，密封备用。

血片溶血固定步骤同前。

用上述染液染10～20min，用％～％稀盐酸脱色片刻，流水冲洗至血膜呈蓝色。

　　血片镜检：

将染色的血片在低倍显微镜下顺序逐个视野检查微丝蚴并计数，根据微丝蚴的大小、体态、折光性、有无鞘膜、表皮是否光滑及内部结构等特征，予以识别。

在高倍镜下观察微丝蚴的体核及头端空隙、神经环、排泄细胞、排泄孔、肛孔、尾核等结构。

必要时需要用油镜作进一步鉴别。

　　H旋毛虫检查　　2009年08月10日发布　　　　2009年08月14日实施