化妆品中利多卡因等7种物质的检测方法中国食品药品检定研究院.docx
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化妆品中利多卡因等7种物质的检测方法中国食品药品检定研究院
附件1
化妆品中利多卡因等7种物质的检测方法
（征求意见稿）
1范围
本方法规定了高效液相色谱法测定化妆品中普鲁卡因胺、普鲁卡因、氯普鲁卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁卡因、辛可卡因的含量。
本方法适用于皮肤用化妆品中液态水基类、液态油基类、膏霜乳液类、凝胶类等化妆品中普鲁卡因胺、普鲁卡因、氯普鲁卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁卡因、辛可卡因含量的测定。
2方法提要
样品处理后，经高效液相色谱仪分离，二极管阵列检测器检测，根据保留时间和紫外光谱图定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量，对于测定过程中有阳性结果的样品，采用液相色谱-质谱法确认。
本方法中各物质的检出限、定量限及取样量为0.5g时的检出浓度和最低定量浓度见表1。
表1各物质的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度
名称
检出限（ng）
定量下限（ng）
检出浓度（μg/g）
最低定量浓度（μg/g）
普鲁卡因胺
10
25
40
100
普鲁卡因
8
20
32
80
氯普鲁卡因
10
25
40
100
苯佐卡因
8
20
32
80
利多卡因
10
25
40
100
丁卡因
10
25
40
100
辛可卡因
8
20
32
80
3试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。
3.1甲醇，色谱纯。
3.2乙腈，色谱纯。
3.3正己烷，色谱纯。
3.4三氯乙酸，优级纯。
3.5甲酸，优级纯。
3.6磷酸，相对密度=1.685，w（H3PO4）=85%，优级纯。
3.7磷酸氢二钠。
3.8氨水，优级纯，含量（NH3）=25%～28%。
3.9混合标准储备溶液：
称取普鲁卡因胺、氯普鲁卡因、丁卡因、利多卡因标准品各0.05g（精确到0.00001g），普鲁卡因、苯佐卡因、辛可卡因标准品各0.04g（精确到0.00001g）置于同一50mL容量瓶中，加甲醇（3.1）使溶解并定容至刻度，摇匀。
3.10流动相的配制：
流动相A：
0.01moL/LNa2HPO4水溶液，H3PO4调pH值至7.0
流动相B：
甲醇
4仪器和设备
4.1高效液相色谱仪，二极管阵列检测器。
4.2天平。
4.3超声波清洗仪
4.4高速离心机
4.5涡旋混合仪
4.6pH计：
精度0.01
4.7固相萃取仪
5分析步骤
5.1样品处理
5.1.1液态水基类、凝胶类
称取样品0.5g（精确到0.0001g）于10mL具塞比色管中，加入甲醇（3.1）2mL，涡旋30s，用甲醇（3.1）定容至刻度，混匀，超声提取20min，以5000r/min离心5min，取上清液经0.45μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液。
5.1.2膏霜乳液类、液态油基类
5.1.2.1膏霜乳液类
称取样品0.5g（精确到0.0001g）于15mL离心管中，加入8mL1%三氯乙酸，2mL乙腈，涡旋1min，5000r/min离心5min，上清液待固相萃取小柱净化。
5.1.2.2液态油基类
称取样品0.5g（精确到0.0001g）于15mL离心管中，加入2mL乙腈饱和正己烷溶液（乙腈∶正己烷=1∶1，超声30min后静置2h，取上层溶液），涡旋1min，超声10min，加入8mL1%三氯乙酸，2mL乙腈，涡旋1min，5000r/min离心5min，下清液待固相萃取小柱净化。
5.1.2.3净化过程
PCX固相萃取小柱依次用3mL甲醇、5mL1%三氯乙酸进行活化。
将待净化的样品清液流经小柱后，用3mL1%甲酸甲醇溶液淋洗小柱，弃去淋洗液，再用10mL的5%氨水甲醇[取5mL氨水（3.8）加甲醇至100mL]洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用甲醇定容至10mL，经0.45μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液。
5.2系列浓度基质标准工作溶液制备
5.2.1液态水基类、凝胶类
称取基质空白0.5g（精确到0.0001g）5份，分别置于10mL具塞比色管中，分别加入混合标准储备溶液0.05mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL，按“5.1.1样品处理”步骤进行前处理，即得。
5.2.2膏霜乳液类、液态油基类
称取基质空白0.5g（精确到0.0001g）5份，分别置于15mL具塞比色管中，分别加入混合标准储备溶液0.05mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL，按“5.1.2样品处理”步骤进行前处理，即得。
各物质基质标准工作溶液系列浓度见表2。
表2各物质基质标准工作溶液系列浓度
名称
普鲁卡因胺
普鲁卡因
氯普鲁卡因
苯佐卡因
利多卡因
丁卡因
辛可卡因
系
列
浓
度
μg/mL
5
4
5
4
5
5
4
10
8
10
8
10
10
8
25
20
25
20
25
25
20
50
40
50
40
50
50
40
100
80
100
80
100
100
80
5.3参考色谱条件
色谱柱：
C18柱，250mm×4.6mm，5μm或等效色谱柱；
流动相梯度洗脱程序：
时间（min）
V（流动相A）/%
V（流动相B）/%
0
40
60
6
40
60
7
20
80
15
20
80
16
40
60
25
40
60
流速：
1.0mL/min；
检测波长：
230nm；
柱温：
30℃；
进样量：
5µL。
5.4测定
在“5.3”色谱条件下，取系列浓度基质标准工作溶液（5.2）分别进样，进行液相色谱分析，分别以基质标准工作溶液系列浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制各物质标准曲线。
取“5.1”项下的待测溶液进样，根据保留时间和紫外光谱图定性，测得峰面积，根据标准曲线得到待测溶液中各物质的浓度。
按“6.1”分别计算样品中7种物质的含量。
6分析结果的表述
6.1计算
式中：
ω——化妆品中各物质的质量分数，μg/g；
——从校准曲线上查得的待测样液中各物质的质量浓度，μg/mL；
V——样品定容体积，mL；
m——样品称样量，g；
D——稀释倍数（不稀释则取1）。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
6.2回收率和精密度
多家实验室验证超声提取法低浓度的平均方法回收率为80.6%~119.2%，相对标准偏差小于13.8%，中浓度的平均方法回收率为81.1%~119.2%，相对标准偏差小于13.1%，高浓度的平均方法回收率为81.2%~118.7%，相对标准偏差小于10.8%。
精密度相对标准偏差小于5.4%（n=6）。
7图谱
图1标准溶液色谱图
1-普鲁卡因胺（3.940min）、2-普鲁卡因（7.672min）、3-氯普鲁卡因（9.453min）、
4-苯佐卡因（13.802min）、5-利多卡因（18.508min）、6-丁卡因（19.916min）、7-辛可卡因（24.719min）。
附录A
（规范性附录）
利多卡因等7种物质阳性结果的确证
A1参考液相色谱-质谱条件
A1.1色谱条件：
色谱柱：
C18，150mm×2.1mm，5μm或等效色谱柱；
流动相：
甲醇+水＝90+10；
流速：
0.3mL/min；
柱温：
30℃；
进样量：
2µL。
A1.2质谱条件：
离子源：
电喷雾离子源（ESI源）。
监测模式：
正离子监测模式；
检测模式：
scan。
A2质谱参考特征离子
表A1利多卡因等7种物质的质谱参考特征离子
编号
物质名称
母离子m/z
子离子m/z
1
普鲁卡因胺
235.90
163.25
120.20
2
普鲁卡因
236.90
100.25
120.20
3
氯普鲁卡因
270.85
100.25
154.10
4
苯佐卡因
166.05
138.10
94.15
5
利多卡因
234.95
86.25
58.05
6
丁卡因
265.25
176.25
72.20
7
辛可卡因
344.30
271.25
116.15
A3定性判定
用液相色谱-串联质谱法对样品进行定性判定，在相同的实验条件下，样品中检出物质的色谱峰保留时间和紫外光谱图与对应物质标准溶液一致，所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对的相对丰度比的偏差不超过下表规定范围，则可以判定样品中存在对应的物质。
表A2阳性结果确证时相对离子丰度比的最大允许偏差
相对离子丰度（k）
k≥50%
50%＞k≥20%
20%＞k≥10%
k＜10%
最大允许偏差
±20%
±25%
±30%
±50%
化妆品中利多卡因等7种物质的检测方法起草说明
为加强化妆品中禁用物质的监督管理，国家食品药品监督管理总局于2013年9月10日委托我所开展化妆品中7种物质（普鲁卡因胺、普鲁卡因、氯普鲁卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁卡因、辛可卡因）检测方法的建立工作，现就起草工作有关情况说明如下：
1起草的必要性
《化妆品卫生规范》2007年版规定利多卡因、普鲁卡因、丁卡因、普鲁卡因胺、氯普鲁卡因、辛可卡因、苯佐卡因、普莫卡因、贝托卡因、布坦卡因、对乙氧卡因等局麻药为禁用物质；从《中国药典临床用药须知化学药和生物制品卷》（2010年版）中查询到临床上经常使用的局麻药包括利多卡因、普鲁卡因、丁卡因、普鲁卡因胺、氯普鲁卡因、辛可卡因、苯佐卡因，有关报道称局麻药可能添加于晒后修复、祛斑、祛痘、脱毛、去角质层、祛皱/抗衰老等化妆品中会给人民身体健康带来潜在的危害，且目前国家标准、商检标准、轻工业标准等均无上述七种物质的检测方法。
本检测方法的制定旨在采用一个方法，同时检测化妆品中这7种物质，并建立该7种物质的确证依据，提供简便和准确筛查和确证7种物质的检测方法，为化妆品中该类物质的的监管提供快速、准确的检测方法，体现我国化妆品检测的水平和对化妆品监管的力度。
2起草原则
本检测方法兼具先进性与可行性，条理清晰，可操作性强的特点，尽量采用目前化妆品检测实验室普遍具备的先进的分析技术，选择准确、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的可操作性和重现性。
3起草过程
国家食品药品监督管理总局于2013年9月10日委托我所开展化妆品中7种物质检测方法建立和验证工作。
通过查阅国内外相关文献资料等调研工作后，我所开始了实验研究，于2013年12月10日就该项工作的进展情况向国家食品药品监督管理总局药化注册司进行汇报。
2014年4月基本完成了该方法的研究和建立工作。
5月，依据《化妆品中禁用物质和限用物质检测方法验证技术规范》（国食药监许[2010]455号）完成本方法实验室内部验证工作，同期我所开始与广东省食品药品检验所、辽宁省药品检验检测院和山东省食品药品检验所交流和沟通实验室间方法验证的事宜，就该方法的适用范围、原理、试剂材料、仪器设备、测定步骤等内容进行了交流，并于6月初交接了验证技术资料、验证用标准品和样品。
三家方法验证单位于7月底陆续将验证材料报送我所，我所将多家实验室方法验证材料进行总结和分析，起草了检测方法和编制说明，并报送国家食品药品监督管理总局。
4重点说明的问题
4.1关于体例
本检测方法的体例主要参照国家食品药品监督管理总局已发布的化妆品中禁限用物质检测方法的体例，便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。
4.2关于7种物质
7种物质：
普鲁卡因胺（CAS号：
51-06-9）、氯普鲁卡因（CAS号：
59-46-1）、普鲁卡因（CAS号：
133-16-4）、苯佐卡因（CAS号：
94-09-7）、利多卡因（CAS号：
137-58-6）、丁卡因（CAS号：
94-24-6）、辛可卡因（CAS号：
85-79-0）是常用的局麻药物，化妆品中为禁用成分。
对目前国内市售晒后修复、祛斑、祛痘、脱毛、去角质层、祛皱/抗衰老等化妆品进行了分析检测，所检测的15种化妆品中，均未检测到含有这7种禁用物质。
为了考察检测方法的准确性和可靠性，选择了两个国药准字的药品（盐酸利多卡因注射液（溶剂用）、林可霉素利多卡因凝胶）作为阳性样品进行了分析检测，该方法能够筛查和确证利多卡因的存在，并且所测含量与其标示量一致。
4.3关于检测方法的建立和验证
经过对化妆品中利多卡因等7种物质样品前处理方法的选择，分析条件的优化，最终建立了化妆品中利多卡因等7种物质的液相色谱检测方法。
方法验证表明，本方法在5~100μg/mL浓度范围内呈线性（相关系数＞0.99），7种禁用物质的最低定量浓度均低于100μg/g，考察的四个基质空白样品对检测结果无干扰，超声提取法低浓度平均方法回收率在80.9%~112.6%，相对标准偏差小于9.5%，中浓度平均方法回收率在86.0%~110.1%，相对标准偏差小于4.3%，高浓度平均方法回收率在87.6%~116.8%，相对标准偏差小于6.5%，上述结果证实，本方法可以满足化妆品中利多卡因等7种物质的检测要求，并最终确定采用基质标准曲线计算化妆品中利多卡因等7种物质的含量。
多家实验室验证低浓度的平均方法回收率为80.6%~119.2%，相对标准偏差小于13.8%，中浓度的平均方法回收率为81.1%~119.2%，相对标准偏差小于13.1%，高浓度的平均方法回收率为81.2%~118.7%，相对标准偏差小于10.8%。
证实所建立方法可作为化妆品中利多卡因等7种物质的检测方法。
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